浦美医学
外泌体研究最大的障碍在于外泌体的分离与收集。之前常用分离技术有基于密度的超高速离心分离、基于抗体的免疫富集分离，以及基于大小的过滤分离等。这些方法存在各种缺点。举例来说，超高速分离，需要极其昂贵的超高速离心机，分离时间长达6-19小时，蛋白杂质污染严重造成纯度低，且在高达10万g的离心力下，可能会造成外泌体的破裂，影响后续检测。免疫分离通常使用EpCAM，CD9，HSP的相关抗体去捕获外泌体，但若细胞自身不表达这些蛋白时，则无法分离。基于抗体的免疫分离极易造成分离的低效和假阴性。而利用大小分离，效率极低，已报道的效率仅有不到2%。主要问题在于外泌体大小不一，又呈类似于红细胞一样的结构，即其厚度有时10纳米都不到。过滤分离用的孔径过小时，得到的外泌体虽然多，但蛋白污染严重，过大时，得到的外泌体由过少。本研究提出利用肝素和EV的相互作用，用肝素修饰的珠子去分离EV，分离效率高，蛋白污染少，不失为一个简单有效的方法。
利用肝素亲和纯化细胞外囊泡
细胞外囊泡（EV）是由细胞释放的脂质膜囊泡。他们携带有包括DNA，RNA和蛋白质在内的，可以转移到受体细胞中的活跃的生物分子。从细胞培养基和体液中分离纯化EVs仍然是一个主要挑战。应用最广泛的分离方法是超速离心（UC），但其需要昂贵的设备，并且只能分离一部分纯的EVs。我们先前的研究表明，肝素能够阻断细胞内EV的摄取，证实了EV-肝素之间直接的相互作用。在这里，我们证实，EV可以利用肝素修饰的珠子，用超滤的方法从细胞培养基以及人血清中进行分离纯化。通过超滤膜纯化得到的EV，携带有EV的标志物Alix,包含有多种多样的RNA谱，并且蛋白污染水平较低。RNA的量和超速离心得到的EV RNA的量相似。总之，我们发现了一个简单且有效的方法，利用与肝素的亲和性来纯化EV。
Heparin affinity purification of extracellular vesicles
Extracellular vesicles (EVs) are lipid membrane vesicles released by cells. They carry active biomolecules including DNA, RNA, and protein which can be transferred to recipient cells. Isolation and purification of EVs from culture cell media and biofluids is still a major challenge. The most widely used isolation method is ultracentrifugation (UC) which requires expensive equipment and only partially purifies EVs. Previously we have shown that heparin blocks EV uptake in cells, supporting a direct EV-heparin interaction. Here we show that EVs can be purified from cell culture media and human plasma using ultra filtration (UF) followed by heparin-affinity beads. UF/heparin purified EVs from cell culture displayed the EV marker Alix, contained a diverse RNA profile, had lower levels of protein contamination, and were functional at binding to and uptake into cells. RNA yield was similar for EVs isolated by UC. We were able to detect mRNAs in plasma samples with comparable levels to UC samples. In conclusion, we have discovered a simple, scalable, and effective method to purify EVs taking advantage of their heparin affinity.
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