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磷酸化组学揭示LRRK2介导Rab 小G蛋白磷酸化与纤毛形成的关联

精准医学与蛋白组学 2019-04-16 12:25:16

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景杰编者按:磷酸化是最重要的可逆蛋白质翻译后修饰之一:通过激酶将ATP的磷酸基团转移到底物蛋白质的特定位点(丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸)上,磷酸化酶去除修饰的磷酸基团而完成可逆的修饰调控磷酸化在调节细胞增殖、发育、分化、凋亡及新陈代谢过程中起重要作用。

研究背景

LRRK2Leucine-rich repeat kinase2)是由PAPK8基因编码的一种蛋白激酶,它的突变会导致PDParkinson’s disease)疾病的发生。Matthias Mann团队在之前的文章中报道过,LRRK2蛋白激酶可以使Rab GTPase蛋白(Rab8A/Rab10/Rab12)的switch-P结构域的保守氨基酸残基磷酸化[1]

Rab GTPase参与蛋白囊泡运输的整个过程,包括囊泡的形成、运输、与细胞膜对接、粘附、锚定和融合等过程。在研究中,Matthias Mann等人系统性地探究了LRRK2的其他Rab蛋白靶标,实验进一步探索突变LRRK2是否可以通过磷酸化Rab GTPase对纤毛形成产生影响。


关键词

LRRK2Rab GTPaseRILPL1/2label-free,磷酸化,纤毛形成

研究思路和成果

为确定能被LRRK2磷酸化的Rab蛋白,研究人员首先在HEK293细胞中分别过表达三种实验体系(图1A):Rab蛋白、Rab蛋白+LRRK2Rab蛋白+LRRK2+LRRK2激酶抑制剂(HG-10-102-01)。在蛋白酶解之前利用免疫沉淀法富集表位标记的Rab家族蛋白,然后采用label-free的质谱方法检测LRRK2的靶标蛋白,结果显示共定量到37Rab蛋白上具有显著表达差异的磷酸化位点,其中14个磷酸化肽段受LRRK2调控,磷酸化肽段丰度在LRRK2激酶表达体系中显著提高,在激酶抑制剂处理体系中显著降低。研究人员用位点特异性抗体验证了Rab29蛋白上T71位和S72位的磷酸化修饰,进一步证明了LRRK2激酶对Rab29蛋白上这两个位点的磷酸化作用。

1 在过表达的HEK293细胞中LRRK2磷酸化14Rab GTPase


接下来研究人员探究了所有LRRK2激酶突变体(G2019S/R1441G/Y1699C)是否同样影响这14Rab蛋白,结果显示13Rab蛋白磷酸化水平上调。在HEK293细胞中过表达致病的LRRK2-Y1699C激酶,通过质谱检测内源性Rab蛋白抗体免疫沉物,结果表明有10个内源Rab蛋白被LRRK2磷酸化(图2)。

2HEK293细胞中LRRK2磷酸化10个内源表达的Rab蛋白


研究人员在探究LRRK2激酶诱导的Rab蛋白磷酸化对蛋白互作的影响时发现,原发性纤毛形成调控因子RILPL2倾向于结合磷酸化的Rab8A蛋白,RILPL2中保守的RH结构域,即为Rab蛋白结合结构域。接着,通过点突变和免疫沉淀等内源性实验验证了RILPL1/2RH结构域的介导下与磷酸化的Rab8A蛋白互作,有研究报道RILPL1/2具有调控原发性纤毛蛋白定位的作用,意味着RILPL1/2相关突变可能PD具有相关性

3 Rab蛋白与RILPL1/2结合依赖于LRRK2激酶磷酸化


LRRK2激酶磷酸化Rab8A/10/12会增强Rab蛋白与RILPL1/2的交互作用,而Rab8ARab10RILPL1/2可以调控原发性纤毛形成,研究人员推断LRRK2自身是否起调控作用。他们在MEF细胞中敲入具有激酶活性的LRRK2-R1441G突变基因后发现LRRK2-R1441G能够影响了纤毛的形成,且其调控作用与激酶活性呈正相关。

4 LRRK2激酶突变抑制原发性纤毛形成

总结:

本研究首次确立了LRRK2与纤毛形成之间的关系,结合免疫沉淀、表位标记富集label-free的组学方法,系统性地揭示了LRRK2激酶可以特异性磷酸化Rab蛋白,磷酸化的Rab蛋白可与原发性纤毛调控因子RILPL1/RILPL2结合,从而影响纤毛形成,在纤毛形成中Rab介导的蛋白转运或信号缺陷可能会导致LRRK2依赖性病理。


参考文献:

[1] Steger M, Tonelli F, Ito G, et al. (2016), Phosphoproteomics reveals that Parkinson's disease kinase LRRK2 regulates a subset of Rab GTPases. Elife, 5: e12813.

[2] Steger M, Diez F, Dhekne H S, et al. (2017), Systematic proteomic analysis of LRRK2-mediated Rab GTPase phosphorylation establishes a connection to ciliogenesis. Elife, e: 31012, 6.



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