磷酸化组学揭示LRRK2介导Rab 小G蛋白磷酸化与纤毛形成的关联

景杰编者按：磷酸化是最重要的可逆蛋白质翻译后修饰之一：通过激酶将ATP的磷酸基团转移到底物蛋白质的特定位点（丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸）上，磷酸化酶去除修饰的磷酸基团而完成可逆的修饰调控。磷酸化在调节细胞增殖、发育、分化、凋亡及新陈代谢过程中起重要作用。

LRRK2（Leucine-rich repeat kinase2）是由PAPK8基因编码的一种蛋白激酶，它的突变会导致PD（Parkinson’s disease）疾病的发生。Matthias Mann团队在之前的文章中报道过，LRRK2蛋白激酶可以使Rab GTPase蛋白（Rab8A/Rab10/Rab12）的switch-P结构域的保守氨基酸残基磷酸化[1]。

Rab GTPase参与蛋白囊泡运输的整个过程，包括囊泡的形成、运输、与细胞膜对接、粘附、锚定和融合等过程。在本研究中，Matthias Mann等人系统性地探究了LRRK2的其他Rab蛋白靶标，实验进一步探索突变LRRK2是否可以通过磷酸化Rab GTPase对纤毛形成产生影响。

LRRK2，Rab GTPase，RILPL1/2，label-free，磷酸化，纤毛形成

为确定能被LRRK2磷酸化的Rab蛋白，研究人员首先在HEK293细胞中分别过表达三种实验体系（图1A）：Rab蛋白、Rab蛋白+LRRK2、Rab蛋白+LRRK2+LRRK2激酶抑制剂（HG-10-102-01）。在蛋白酶解之前利用免疫沉淀法富集表位标记的Rab家族蛋白，然后采用label-free的质谱方法检测LRRK2的靶标蛋白，结果显示共定量到37个Rab蛋白上具有显著表达差异的磷酸化位点，其中14个磷酸化肽段受LRRK2调控，磷酸化肽段丰度在LRRK2激酶表达体系中显著提高，在激酶抑制剂处理体系中显著降低。研究人员用位点特异性抗体验证了Rab29蛋白上T71位和S72位的磷酸化修饰，进一步证明了LRRK2激酶对Rab29蛋白上这两个位点的磷酸化作用。

图1 在过表达的HEK293细胞中LRRK2磷酸化14个Rab GTPase

接下来研究人员探究了所有LRRK2激酶突变体（G2019S/R1441G/Y1699C）是否同样影响这14个Rab蛋白，结果显示13个Rab蛋白磷酸化水平上调。在HEK293细胞中过表达致病的LRRK2-Y1699C激酶，通过质谱检测内源性Rab蛋白抗体免疫沉物，结果表明有10个内源Rab蛋白被LRRK2磷酸化（图2）。

图2在HEK293细胞中LRRK2磷酸化10个内源表达的Rab蛋白

研究人员在探究LRRK2激酶诱导的Rab蛋白磷酸化对蛋白互作的影响时发现，原发性纤毛形成调控因子RILPL2倾向于结合磷酸化的Rab8A蛋白，RILPL2中保守的RH结构域，即为Rab蛋白结合结构域。接着，通过点突变和免疫沉淀等内源性实验验证了RILPL1/2在RH结构域的介导下与磷酸化的Rab8A蛋白互作，有研究报道RILPL1/2具有调控原发性纤毛蛋白定位的作用，意味着RILPL1/2相关突变可能与PD具有相关性。

图3 Rab蛋白与RILPL1/2结合依赖于LRRK2激酶磷酸化

LRRK2激酶磷酸化Rab8A/10/12会增强Rab蛋白与RILPL1/2的交互作用，而Rab8A、Rab10与RILPL1/2可以调控原发性纤毛形成，研究人员推断LRRK2自身是否起调控作用。他们在MEF细胞中敲入具有激酶活性的LRRK2-R1441G突变基因后发现LRRK2-R1441G能够影响了纤毛的形成，且其调控作用与激酶活性呈正相关。

图4 LRRK2激酶突变抑制原发性纤毛形成

本研究首次确立了LRRK2与纤毛形成之间的关系，结合免疫沉淀、表位标记富集与label-free的组学方法，系统性地揭示了LRRK2激酶可以特异性磷酸化多个Rab蛋白，磷酸化的Rab蛋白可与原发性纤毛调控因子RILPL1/RILPL2结合，从而影响纤毛形成，在纤毛形成中Rab介导的蛋白转运或信号缺陷可能会导致LRRK2依赖性病理。