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【收藏干货】离子交换层析常见问题解析

生物制药合伙人 2019-03-14 14:54:55

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离子交换层析常见问题解析


摘要:我们都知道在试验成功的背后都有很多不为人知的心酸,但如果你不自己亲身体验,你就永远只是知道,永远都是站在巨人肩膀上的矮子。本文就是根据自身实验经验总结。望留言批评指正!

01 如何根据蛋白pI选择离子交换填料

a. 缓冲液 pH≥目的蛋白pI 0.5-3个单位选择弱阴离子交换填料(DEAE)

b. 缓冲液 pH≥目的蛋白pI 3个蛋白以上选择强阴离子交换填料(Q)

c. 缓冲液 pH≤目的蛋白pI 0.5-3个单位选择弱阳离子交换填料(CM)

d. 缓冲液 pH≤目的蛋白pI 3个单位以上选择强阳离子交换填料(SP)

e. 缓冲液中含有较高离子强度时选择复合型离子交换填料(MMC/MMA)

☀根据pI选择只能做为参考,不能完全依据pI选择,因为蛋白是局部电荷和离子交换填料以静电力的形式结合。

02 如何根据填料基质选择合适载量的离子交换填料

a. 最高载量的就选择葡聚糖交流琼脂糖基质的填料(XL)

b. 常规载量的就选择琼脂糖基质的填料(FF/HF)

03 如何选择合适流速和分辨率的填料

根据离子交换填料的粒径分布选择,原则上粒径越小分辨率越高。

a. 快速捕获选择流速大的(BB 165-300um)

b. 初步纯化选择粒径适中的(FF  45-165um)

c. 精细纯化或者科研用选择高分辨率的(HP 25-45um)

☀同一材料基质的填料,粒径越小反压越大,流速越小

04  汇研生物离子交换填料推荐

a. XL基质的离子交换填料有很高的载量,其分辨率和FF基质的相当,但载量很高,在工业生产中有明显的载量优势,明显的成本优势。

b. HPR基质的离子交换填料,具备高分辨率,高流速,高载量,高回收率等众多优势,其在处理比较复杂的样品时有显著优势。

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05  离子交换层析缓冲液的选则

用Tris-HCl还是PB,选择的依据是蛋白质的稳定性和活力在哪个缓冲液中好,浓度一般10-50mM,但是缓冲液应与样品缓冲液有相同的pH和离子强度。

06  纯化时目标蛋白不结合或结合量较低

a. 孵育时间太短:降低上样量和上样流速。

b. 填料中沉积的杂质太多,导致填料结合能力下降:及时对填料进行清洗

c. 缓冲液不合适:优化缓冲液离子强度和pH

d. 目的蛋白和填料带相同电荷:更换填料或者优化缓冲液

e. 填料没平衡好,未完全解离:增加平衡柱体积数及优化缓冲液

07  目标物纯度较低

a. 样品复杂或者前处理不到位:层析前离心或过滤处理样品,或者优化层析体系,选择合适的离子交换填料和层析体系(缓冲液)

b. 样品粘度态高:用缓冲液适当的稀释样品,或者选择高分辨率填料(如SP-HPR等进行优化,降低上样量等尝试优化。

c. 清洗不彻底:增加清洗的柱体积数

d. 洗杂不彻底:优化洗杂的条件,增加洗杂的柱体积数

e. 目标物出现降解:优化层析条件,选择合适的层析条件或者添加蛋白稳定剂等

f.  柱料装填效果不佳:装填的不均匀,柱效低,重新装柱

g. 分离柱顶部有较大的储样体积:装柱避免分布器离柱料上层液面太高,应保持在0.5cm高度以内。

h. 洗脱条件不佳:优化洗脱条件,比如缓慢的拉盐梯度洗脱

i.  填料分辨率下降:对填料进行清洗或者更换填料。

08  柱床有漏缝或干涸

检查系统的密闭性,避免气体进入系统,避免频繁的大幅度改变过柱流速。若出现此现象就要重新装柱。

09  洗脱峰拖尾

a. 洗脱强度不够:增大洗脱强度

b. 柱子装的均匀:重新装柱

c. 柱床上端液面太高:柱床上端液面控制在0.5cm以内。

10  目标蛋白没有洗脱下来或者洗脱下来的蛋白量较少

a. 洗脱强度不够:增加洗脱的离子强度

b. 目标蛋白在洗脱过程中发生聚集沉淀:优化洗脱条件

c. 发生非特异性结合:优化层析条件

d. 填料载量太低:更换合适的层析填料

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