很多蛋白类药物（如胰岛素）一般在酵母细胞中进行大规模生产，其中宿主细胞的残留DNA（Host Cell Residual DNA，下文简称HCD）存在潜在的健康风险，所以各国药品监管部门对宿主残留DNA的含量都制定了严格的标准。美国FDA和WHO（世界卫生组织）的标准如下：1上限为100pg/剂量2如单抗类药物等大剂量情况下，上限为10ng/剂量3U.S. Food and Drug Administration （2012）. FDA Briefing Document: Vaccines and Related Biological Products Advisory Committee Meeting, September 19, 2012. Cell Lines Derived from Human Tumors for Vaccine Manufacture, pp. 17–25.4World Health Organization （1997）. WHO Expert Committee on Biological Standardization: Highlights of the 46th Meeting, October 1996. WHO Weekly Epidemiological Record 72, 141–145. 在此背景下，灵敏、可靠地对HCD进行检测成为确保生物制剂安全的重要一环。其中荧光定量PCR技术是最常用的方法之一，其结果的灵敏度主要依赖于样品中核酸的提取效率和PCR扩增的效率。本期介绍默克公司（Merck Research Laboratories, Kenilworth, NJ, USA）尝试的一种新方法——采用微滴式数字PCR直接对毕赤酵母属DNA进行检测，并将ddPCR与qPCR的结果进行了对比。 背景1默克公司对蛋白类药物中HCD的标准是：不能超过1.0pg/mg药物。因此需要灵敏、可靠的检测方法。2将现有荧光定量PCR检测体系直接用于ddPCR，并将蛋白类药物（人重组IgG1-Fc蛋白RP-1和胰岛素）直接加入毕赤酵母属DNA中进行检测，不对样品进行蛋白酶消化处理。 方法学的建立1HCD检测靶分子：毕赤酵母属的18s rRNA。经典的TaqMan检测，探针为FAM标记。2qPCR检测平台：AB 7900HT Fast Real-Time PCR System及SDS 2.4分析软件。3ddPCR检测平台：QX200 Automated System及QuantaSoft ver. 1.7.4.0917分析软件。4检测体系的特异性分析：毕赤酵母属DNA检测体系不会与常见的CHO、大肠杆菌发生交叉反应，有良好的特异性。 5检测体系的线性范围：0.6fg~60,000fg。6检测的批内相对标准差（RSD）：60fg以上含量时小于21%，6fg时小于41%，0.6fg时约173%。7检测的批间相对标准差（RSD）：6fg以上含量时小于21%，0.6fg时约102%。8上述线性范围及RSD均通过对梯度稀释的毕赤酵母属DNA标准品分析获得。具体结果见下图B03-G03，其中紫红色的水平线为软件自动给出的阈值线。 加入RP-1后的直接检测1目的：测试在加入RP-1的情况下，是否能直接进行ddPCR分析。之前的测试表明：荧光定量PCR可直接进行分析的浓度是5mg/mL，检测量为5ug。2分别测试了50mg/mL、10mg/mL和5mg/mL三个浓度，结果发现在5mg/mL（检测量为25ug）的情况下ddPCR能进行直接的检测。50mg/mL的情况下RP-1的存在会影响到微滴的生成。3共采用了三个批次的RP-1进行了测试，分别在不同的天数进行了重复，结果的精确度和准确性见下表。其中精确度采用RSD评估，准确性采用Spike Recovery（%）评估。原始数据见上图的B08-G08。4结果显示：25ug的RP-1情况下，ddPCR对6fg以上毕赤酵母属DNA的检测能够确保结果的精确度和准确性。 加入胰岛素的检测1测试的条件与RP-1相同，分别测试了50mg/mL、10mg/mL和5mg/mL三个浓度，结果发现在10mg/mL（检测量为50ug）的情况下ddPCR能进行直接的检测。50mg/mL的情况下胰岛素的存在会影响到微滴的生成。2结果显示：50ug的胰岛素情况下，ddPCR对6fg以上毕赤酵母属DNA的检测能够确保结果的精确度和准确性。原始数据见上图中的B10-G10，精确度及准确性数据见下表。 ddPCR HCD检测总结1本研究中以毕赤酵母属DNA为检测对象，探讨了ddPCR检测的线性范围：0.6fg~60,000fg。ddPCR的LOQ为6.0fg。2ddPCR的检测灵敏度至少比qPCR高5倍，甚至能满足小于1.0pg/mg蛋白的检测要求。3本研究建立的方法无需对样品进行繁琐的核酸提取及蛋白酶消化，结合ddPCR检测无需标准品的特点，进一步提高了检测结果的可比性。 下期预告数字PCR助力流感疫苗生产工艺的提高封面图片来自网络。欢迎个人转发分享，公众号或机构如需转载，请联系授权：delfi@263.net 一起穷尽数字PCR的各种可能性扫描订阅“数字PCR的可能性”