PNAS II 在神经退行性疾病阿兹海默症模型中检测蛋白质的亚硝基化翻译后修饰

本周给大家分享一篇2016年4月发表在PNAS上的文章，文章题目为S-nitrosation of proteins relevant to Alzheimer’s disease during early stages of neurodegeneration。文章通讯作者是麻省理工学院的Steven R. Tannenbauma教授，他的研究方向主要是：生物质谱、一氧化氮化学和病理生理学、药物开发和化学毒性的组织工程、以及药物和致癌物代谢的定量超微量测量。

文章工作基于protein S-nitrosation (SNO-protein)展开，SNO-protein是一氧化氮介导的半胱氨酸硫醇的翻译后修饰，是生理学和病理学通路中一种重要的蛋白质功能调节机制。阐明S-nitrosation对蛋白质功能调节机制的关键的第一步是识别靶向的半胱氨酸残基。据此，作者提出了一种策略——SNOTRAP(SNO trapping by triaryl phosphine)，该策略是一种直接标记技术，可以富集和识别SNO-protein及其同源的SNO-site。

SNOTRAP探针由三苯基膦硫酯、聚乙二醇和生物素分子三部分组成，其中三苯基膦硫酯与RSNO反应，第一步产生azaylide中间体，该中间体通过适当的定位亲电试剂（硫酯）重排形成二硫化亚氨基正膦，反应通过施陶丁格连接机理进行，保留了氮原子和巯基部分，找到了肽中明确的SNO-特异性位点，随后发生生物素介导的标记肽/蛋白质的亲和捕获。聚乙二醇对三苯基膦硫酯和生物素分子起连接作用。

为识别SNO-蛋白和SNO-位点，作者使用了两种互补的方法，方法A：对于识别SNO-蛋白，SNOTRAP修饰的蛋白通过抗生物素蛋白链霉亲和力而富集，通过LC-MS/MS分析胰蛋白酶肽，通过数据库搜索鉴定蛋白质。但是使用方法A的SNO位点的识别由于SNOTRAP标签在质谱中产生额外的特征而被阻断。故开发方法B：用N-乙基马来酰亚胺代替SNOTRAP标签（改变体系大小），使MS直接分析检测SNO-位点，在链霉抗生物素蛋白捕获之前进行蛋白水解消化以分离含有SNOTRAP标签的修饰肽段（不是完整的SNO蛋白质），随后裂解SNOTRAP标签，用三羧基乙基膦（TCEP）洗脱肽，并在nLC-MS/MS之前用NEM标记释放的Cys。这种方法选择性地富集只含有SNO的肽，这就减少了nLC分离的复杂性，改善了SNO-site检测。

图1 探针作用机理

图2 对亚硝基化蛋白质的检测及位点确定

作者基于此方法随后还开展了一系列工作，包括使用具有类似阿兹海默症的神经退行性疾病的CK-p25小鼠模型，来确认SNO-protein及其同源SNO-Cys site在神经退行性疾病中的时间变化、通过使用总体对照的SNO-proteome和CK-p25-specific脑皮层中的SNO-proteome对生物过程和KEGG通路的基因本体进行了分析，来破解早期神经退行性疾病发病过程中SNO-protein对分子和细胞系统产生的可能影响，以及使用probability LOGO（pLOGO）工具来分析SNO-Cys残基为线性基序（45）的侧翼序列，来阐明SNO-Cys site的共同特征。

       总之，SNOTRAP策略可以对有神经退行性疾病的大脑中的S-nitrosation的进行一个综合的评估，该评估可应用于多种细胞和疾病背景，并且在生物标志物发现和药物开发治疗方面具有很大的潜力。