PNAS|重磅,自韩春雨撤稿以后,Ago蛋白重出江湖,在RNA编辑具有多重新应用

2023-05-10 14:56:27

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iNature:2018年3月12日,加利福尼亚大学伯克利分校Cate研究组在PNAS杂志发表题为“Programmable RNA recognition using a CRISPR-associated Argonaute”的研究论文,该论文拓宽了我们对Argonautes与指导和底物RNAs相互作用的机制理解,并且证明具有5'-BrdU修饰的gRNA的MpAgo RNP可以用作高度特异性的RNA靶向平台来探测RNA生物学。



Argonautes(Agos)是核酸引导的蛋白质,存在于三个领域的生物体中(真核生物,细菌及古细菌)【1】。在真核生物中,Argonautes(eAgos)在RNA干扰(RNAi)和micro-RNA(miRNA)途径中扮演重要角色,它们协调各种细胞过程,包括转录和翻译基因调控【2,3】,沉默移动遗传元件【4,5】和参与防御过程【6】。 eAgos结合单链RNA(ssRNA),例如小干扰RNA(siRNA),miRNA或piRNA,其充当用于识别互补ssRNA靶标的模板,导致靶向RNA的Ago切割【7】或招募RNA降解机制的其他组分【8-10】。


虽然原核生物缺乏RNAi途径【11】,但原核Agos(pAgos)被认为可以帮助抵御外源DNA的宿主防御功能【12】。尽管它们在结构上与eAgos相似,但pAgos在生物化学行为上比真核生物行为更加多样化。例如,一些pAgos可以使用DNA或RNA,可以靶向DNA或RNA底物【12-15】。


与其他Agos不同,在Marinitoga piezophila,Thermotoga profunda和Marinitoga sp1155中发现CRISPR基因座相关的pAgo亚家族是使用5'-羟基化(5'-OH)导向RNA(gRNA)而不是5'-磷酸化【16】。此外,M. piezophila Ago(MpAgo)以gRNA依赖性方式体外切割ssDNA和ssRNA【16】。然而,内源性MpAgo的起源和MpAgo的生理功能仍然谜。


在这里加利福尼亚大学伯克利分校Cate研究组进行了MpAgo指导依赖的RNA靶向的生化分析。发现MpAgo很容易用gRNA编程来形成RNA-蛋白质复合物(RNP)。重构的MpAgo RNPs以中等的亲和力和特异性结合完全互补的RNA底物。然而,在gRNA的5'末端掺入5-溴-2'-脱氧尿苷(BrdU)稳定了MpAgo-gRNA复合物(MpAgo RNP),并大大提高了MpAgo RNP亲和力和结合底物RNA的特异性。此外,具有5'-BrdU gRNA的MpAgo RNP选择性地结合仅相差一个核苷酸的底物,这使得能够从复杂混合物中分离肌苷编辑的RNA底物。这些MpAgo RNP可用于区分单核苷酸变体并鉴定编辑的A到靶RNA。 未来,应该有可能使用5'-BrdU gRNA加载的MpAgo RNP来分析,成像和操作单核苷酸分辨率的活细胞中未标记的RNA。



原文链接:

http://www.pnas.org/content/early/2018/03/09/1717725115.full



参考文章:

1. Swarts DC, et al. (2014) The evolutionary journey of Argonaute proteins. Nat Struct Mol Biol 21:743–753. 

2. Volpe TA, et al. (2002) Regulation of heterochromatic silencing and histone H3 lysine- 9 methylation by RNAi. Science 297:1833–1837.

3. Sigova A, Rhind N, Zamore PD (2004) A single Argonaute protein mediates both transcriptional and posttranscriptional silencing in Schizosaccharomyces pombe. Genes Dev 18:2359–2367. 

4. Tabara H, et al. (1999) The rde-1 gene, RNA interference, and transposon silencing in C. elegans. Cell 99:123–132. 

5. Houwing S, et al. (2007) A role for Piwi and piRNAs in germ cell maintenance and transposon silencing in Zebrafish. Cell 129:69–82. 

6. Wilkins C, et al. (2005) RNA interference is an antiviral defence mechanism in Caenorhabditis elegans. Nature 436:1044–1047. 

7. Liu J, et al. (2004) Argonaute2 is the catalytic engine of mammalian RNAi. Science 305: 1437–1441. 

8. Wu L, Fan J, Belasco JG (2006) MicroRNAs direct rapid deadenylation of mRNA. Proc Natl Acad Sci USA 103:4034–4039. 

9. Giraldez AJ, et al. (2006) Zebrafish MiR-430 promotes deadenylation and clearance of maternal mRNAs. Science 312:75–79. 

10. Behm-Ansmant I, et al. (2006) mRNA degradation by miRNAs and GW182 requires both CCR4:NOT deadenylase and DCP1:DCP2 decapping complexes. Genes Dev 20: 1885–1898. 

11. Shabalina SA, Koonin EV (2008) Origins and evolution of eukaryotic RNA interference. Trends Ecol Evol 23:578–587. 

12. Olovnikov I, Chan K, Sachidanandam R, Newman DK, Aravin AA (2013) Bacterial argonaute samples the transcriptome to identify foreign DNA. Mol Cell 51:594–605. 

13. Swarts DC, et al. (2014) DNA-guided DNA interference by a prokaryotic Argonaute. Nature 507:258–261. 

14. Yuan Y-R, et al. (2005) Crystal structure of A. aeolicus argonaute, a site-specific DNAguided endoribonuclease, provides insights into RISC-mediated mRNA cleavage. Mol Cell 19:405–419. 

15. Swarts DC, et al. (2015) Argonaute of the archaeon Pyrococcus furiosus is a DNAguided nuclease that targets cognate DNA. Nucleic Acids Res 43:5120–5129. 

16. Kaya E, et al. (2016) A bacterial Argonaute with noncanonical guide RNA specificity. Proc Natl Acad Sci USA 113:4057–4062




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