单细胞新转录组+单细胞蛋白组,最佳CP!

 

今天小编给大家带来一篇影响因子43分很耗“脑力”的文章。

 

经过2017年的洗礼，单细胞在基因组和转录组的高分文章频出，单细胞研究的火热时代正式到来。但是一直有科研达人们提出：细胞与蛋白之间的关系错综复杂只能用基本的荧光蛋白标记法示踪找出？细胞特征基因与蛋白的表达关系扑朔迷离能帮我们理清？不要着急，10X Genomics平台可为你点亮一盏明灯，解决这些问题！下面小编带来了一篇单细胞测序与蛋白同时测定的高分文章供各位科研达人参考。

 

 

 

Multiplexed quantification of proteins and transcripts in single cells

 

期刊：Nature Biotechnology 影响因子：43.113

发表单位：美国马萨诸塞州波士顿默克公司遗传学

和药物基因组学转化医学部

 

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背景介绍

 

2017年单细胞测序（scRNA-seq）在科研领域取得的成就有目共睹，随着scRNA-seq通量的增加，其能够用于鉴定和表征新型或稀有细胞类型，此外还有助于深入了解细胞发育的潜在机制、治疗干预的响应机制。然而，药物的主要靶点是蛋白质并不是mRNA，且蛋白质丰度不一定与mRNA丰度一致。该文章通过REAP-seq可以同时测量单细胞中的蛋白质和mRNA。通过类似于流式细胞术的方法标记细胞——用缀合于DNA条形码的抗体代替荧光团。

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原理概述

 

在用细胞条形码引物标记含有磁珠的离散液滴之前，用Ab-条形码标记细胞。在液滴形成后，细胞被裂解，聚腺苷酸化的mRNA和AbB与聚（dT）细胞条形码化的引物杂交。REAP-seq利用逆转录酶的DNA聚合酶活性同时扩增杂交AbB，并在相同反应中从mRNA合成互补DNA；然后破碎液滴乳状液，并将细胞条形码化的AbB序列（〜155bp）从源自mRNA的细胞条形码cDNA（>〜500bp）进行大小分级分离。（图1）

 

图1 REAP-seq示意图

 

 

 

制备mRNA和蛋白质文库并测序。（图2）

 

图2 REAP-seq蛋白和mRNA文库制备概述

 

含有八个核苷酸的DNA条形码提供了高达65,536个独特的指标；用作扩增和测序的通用引物序列为33bp Nextera Read 1，独特的8bp抗体条形码（Ab BC），用于引发细胞条形码的24-25bp 聚（dA）序列 (图3)。使用标准的10X Genomics 平台处理多余的未结合的抗体条形码（AbBC）；基于液滴的系统，标准细胞是被抗体条形码标记的，设计用于计数数千单细胞。

 

图3 DNA条形码抗体的示意图

 

REAP-seq利用逆转录酶的DNA聚合酶活性同时延长已结合的AbB与poly（dT）细胞条形码，并在相同的反应中合成来自mRNA的互补DNA。然后使用外切核酸酶I从蛋白质双链DNA（〜155bp）产物中降解所有过量的未结合的单链寡核苷酸。

 

硫酸葡聚糖加入到AbB并使用同种型对照（小鼠IgG1，小鼠IgG2a，小鼠IgG2b，大鼠IgG1，大鼠IgG2a）来确定背景的阈值噪音。在PBMC中观察到针对CD8的两种单克隆抗体（克隆RPA-TA和SK1）之间的高相关性（R2= 0.95），表明单细胞蛋白测量的高特异性和可重现性。（图4）

 

图4 评估REAP-seq蛋白质测定中的特异性结合

 

 

 

3 

平台验证

 

 

 

3.1 使用PBMC初步测试REAP-seq

 

用45种AbB的混合物染色PBMC，然后磁富集3个细胞群体：CD3+T细胞，CD11b+骨髓细胞和CD19+B细胞。细胞条形码在基因和蛋白质表达矩阵中被识别鉴定，显示了三个容易辨别的细胞群，且被用作阳性对照来评估REAP-seq方法测量的mRNA和蛋白质的灵敏度和特异性（图5）。

 

 

图5 在PBMC中的REAP-seq的t-SNE

 

REAP-seq同样作为对照，单独对PBMC进行scRNA-seq以确保蛋白质测定对mRNA测量没有影响（图6）。

 

图6 REAP-seq基因表达与标准scRNA-seq基因表达相比较

 

将REAP-seq蛋白质测量结果与流式细胞仪进行比较，发现四种主要细胞类型的相对丰度一致。CD45RO和CD45RA的REAP-seq蛋白测量结果也与流式细胞术数据一致，显示CD20+B细胞中CD45RA高表达和CD14+单核细胞中CD45RO高表达（图7）。 以上并不是通过3'端mRNA测序得到的，证明了REAP-seq在单独测定蛋白质和转录物中的效用。

 

图7 REAP-seq蛋白质测量结果与流式细胞仪结果比较

 

3.2 使用 REAP-seq验证CD8+T细胞的体外激活

 

激动剂单克隆抗体CD27（aCD27）已被证明可用于有效调节免疫反应，包括在临床上抗肿瘤免疫。我们使用REAP-seq来表征具有aCD27和TCR刺激的初始CD8+T细胞的体外激活。在一个80 AbBs面板上，使用抗CD3（aCD3）和抗CD28（aCD28）抗体或aCD27，aCD3和aCD28抗体（图8）处理来自三个个体供体血液的原始CD8 +T细胞。 通过流式细胞仪分选活细胞后，将细胞装载到10X Genomics Chromium Controller仪器上。

 

图8 REAP-seq表征aCD27体外激活初始CD8+T细胞

 

使用REAP-seq分析用aCD27处理的细胞（图9）。REAP-seq测定的蛋白质部分在用AbB1或AbB2标记的珠粒混合物上进行。散点图显示与每个珠子相关的AbB计数的数量。蓝点表示为AbB 1特异性的珠子;红点表示AbB 2特异性的珠子。在鉴定的574个珠中，4个具有混合表型，这表明外切核酸酶I步骤成功地降解过量的未结合的单链条形码并防止AbB与来自不同珠的细胞条形码之间的串扰。用10种不同AbB之一标记的1,082个珠中鉴定的簇通过REAP-seq蛋白管道。根据最大计数数量的AbB，珠子被分配一种颜色。如预期的那样，为AbB确定了10个簇。

 

图9 使用AbB标记的抗小鼠IgG珠鉴定REAP-seq蛋白测定

 

对于每个供体，将经aCD27处理的和未处理的样品合并成数字基因或蛋白质表达矩阵，并进行无监督聚类。虽然蛋白质标记的数量远远少于基因标记的数量，但是当仅使用蛋白质表达进行聚类分群，来自不同处理条件的细胞之间呈现明显的分群效果。（图10）

 

图10 不同的处理条件对细胞进行颜色编码，以显现t-SNE图中细胞的共定位

 

在每个供体的经aCD27处理的和未经处理的初始CD8+T细胞中差异表达的基因和蛋白质被鉴定，差异表达的基因和蛋白质为P值<0.01、倍数变化>1.3的那部分。 在所有三个捐助者中，有74个重叠的差异表达基因（图11）。 在此重叠基因组中，细胞增殖标志物MKI67在经CD27处理的细胞中上调，与之前发现的TCR和CD27共激活的T细胞诱导显着水平的增殖相一致。

 

图11 在所有三个捐助者中，有74个重叠的差异表达基因

 

mRNA和蛋白质水平并不总是相关的，蛋白质定量对于具有较低丰度mRNA转录物如ICOS的标记物更敏感。ICOS是一种免疫检查点蛋白，在用CD27和T细胞受体（TCR）信号协同刺激时，显示出增强细胞表面表达。 我们发现在蛋白质水平ICOS表达增加，但在转录水平ICOS表达没有增加。我们推测——蛋白质测定的敏感性增加可能是由于蛋白质半衰期较长，绝对蛋白质丰度比mRNA高。 另外，由于与每个抗体缀合的多于一个的DNA条形码（每个抗体的平均三个DNA条形码），这种信号扩增对蛋白质测定有益。

 

3.3 使用 REAP-seq鉴定未知的细胞群体

 

为了证明REAP-seq如何用于表征未知的细胞群，我们使用REAP-seq来鉴定存在于我们富集的初始CD8 +T细胞（图中圈出的异常群）中的一小部分细胞（图12）。 在所有三个供体中，在这个异常簇和其余细胞之间共有17个差异表达的蛋白质。

 

图12 鉴定存在于我们富集的初始CD8 + T细胞中的一小部分细胞

 

在mRNA水平上，三个供体中有异常表达的56个重叠基因，其中三个（HLA-DRA，CD27和CD2）也在蛋白质上差异表达（图13）。

 

图13 三个供体中在蛋白质上差异表达基因

 

近来发表了类似于REAP-seq的方法——CITE-seq，其使用DNA条形码化的抗体和高通量的scRNAseq结合。两种方法之间的区别在于DNA条形码如何与抗体结合。①REAP-seq通过使用在抗体和胺化的DNA条形码之间产生小的，稳定的共价键的单向化学来最小化空间位阻和潜在的串扰；②CITE-seq，在与生物素化的DNA条形码非共价结合之前，平均每种抗体（〜150kDa）上有两个庞大的链霉抗生物素蛋白（各50kDa）。

 

 

 

结果

 

 

 

上文中，我们通过将多达82种抗体缀合到独特的DNA条形码上来展示REAP-seq的前所未有的可扩展性。

 

REAP-seq很容易适应其他微流体或微米/纳米孔平台，也可以应用于批量样品同时测量蛋白质和RNA。最近的研究表明对在固定的细胞上scRNA-seq是可能的，我们预计REAP-seq可以扩展到测量细胞内信号通路，B细胞或T细胞受体测序以及其他基因组DNA读数，如点突变和拷贝数变异。REAP-seq还可以与多种类型的干扰相结合，如小分子，RNA干扰，CRISPR和其他基因编辑技术，以提供对疾病和治疗反应有关的细胞表型的洞察。