荧光光谱技术在废水溶解有机物研究中的应用进展(温馨, 张淑荣等)

关键词

Key words

荧光光谱技术原理

荧光光谱技术是一类利用物质的荧光特性进行定性和定量分析的方法。图 1 为 Jablonski能级图，表征了荧光产生的具体过程。由于溶解有机物的结构中具有发色基团，经过一定波长的光的照射后，分子由基态跃迁到激发态，处于激发态的分子不稳定，将以多种形式释放能量回到基态。当分子处于第一激发单重态 S1 的最低振动能级时，可能通过发射光子跃迁回到基态 S0 的各个振动能级上，在该过程中会发射荧光。通过光谱仪所提供的检测器可以对荧光峰的激发和发射波长及其荧光强度进行分析。下面介绍了荧光光谱技术中两种主要技术三维荧光光谱和同步荧光光谱的基本原理。

三维荧光光谱技术是一种发展快速、应用广泛的荧光分析手段。其原理是将不同激发波长和发射波长下的荧光强度以三维图的形式展示。图 2 为典型生活污水三维荧光图谱[4]，图中三个维度分别表示激发波长、发射波长和荧光强度，通过对等高线的分析可以得出各物质特征峰的位置及荧光强度，生活污水中主要的污染成分是类蛋白类物质。

为了进一步的理解物质的特征峰，需要运用数据分析方法对所得到的三维图进行解析。常见的分析方法有峰值法、区域积分法、主成分分析、平行因子分析等。而平行因子分析是在主成分分析的基础上发展起来的，近几年来运用广泛。它将激发-发射矩阵降维成一个唯一荧光合适的数据集和一个残差集，同时量化了各荧光成分的荧光强度，实现了复杂荧光图谱的化学计量学分离。

就物质的特征峰而言，内滤和散射均会对其位置产生影响。内滤效应在浓溶液中经常发生，它会导致物质的特征峰发生红移或者蓝移。散射的影响主要是由大分子的颗粒和胶体物质导致的。通过稀释待测溶液可以降低两种效应对结果的影响。在荧光光谱图中，除了物质的特征峰之外还存在拉曼散射和瑞利散射的干扰峰。拉曼峰是一条线性的轨迹，位于 260-350nm/280-400 nm 的范围内。一级瑞利散射位于激发和发射波长相等的位置，与拉曼峰位置相近。二级瑞利散射位于发射波长是激发波长两倍的区域，会对某些物质特征峰的峰型和峰强度产生较大的影响。这两项干扰均可以通过对空白超纯水水样的扣除来去除。图 3 显示了纯水水样中拉曼及瑞利散射的特征峰。

同步荧光扫描是同时扫描激发和发射波长，由测得的荧光信号与激发波长（或者发射波长）形成光谱图，即同步荧光光谱图。广义上，同步荧光光谱技术根据激发和发射波长间的关系可以分为恒波长同步荧光光谱技术、恒能量同步荧光光谱技术、可变角同步荧光光谱技术和恒基体同步荧光光谱技术。

恒波长同步荧光光谱技术，即狭义上的同步荧光光谱技术。其原理是在扫描过程中，激发波长和发射波长间保持恒定的波长间隔 Δλ（ Δλ=Δλem-Δλex），在一定的波长范围内得到物质的特征荧光光谱图。由于 Δλ 的值限定了吸收和发射荧光的范围，因此得到的物质的特征峰就比传统的荧光激发光谱和发射光谱更尖锐。同时随着 Δλ 值的变化，特征峰的数量、形状、强度等均发生变化。图 4 为生活污水同步荧光光谱图[5]， Δλ=30 nm 时，在激发波长为 290 nm 左右出现了最大荧光峰，表明生活污水中类蛋白类物质含量较高。

恒能量同步荧光光谱技术的原理是在同步扫描过程中， 激发和发射波长保持一恒定能量差 Δν， 据此得到物质的特征光谱。 该技术可以克服拉曼光的影响， 同时提高分析的灵敏度。可变角同步荧光光谱技术是在检测过程中， 激发和发射波长在不同的方向或以不同的速率进行扫描得到光谱图，该技术的光谱分辨率极佳。恒基体同步荧光光谱技术，也被认为是非线性可变角同步荧光光谱技术的一种，其原理是在等高线图中将基体（干扰物）荧光强度相等的点连接起来得到等荧光强度线，沿着该线进行扫描得到物质的特征谱图。

荧光光谱技术在废水荧光

有机物研究中的应用

1996 年 Coble 等运用三维荧光光谱技术分析了海水中的溶解有机物。此后，荧光光谱技术在废水荧光有机物的研究中应用广泛，取得了许多重要的研究成果。表 1 中列出了几种荧光团的荧光范围[6]，其中荧光增白剂、木质素、腐殖质、氨基酸、多环芳烃等来源复杂，是废水中常见的溶解有机物。下面对荧光光谱技术在以上几种荧光团的定性和定量研究中的应用进行综述。

荧光增白剂， 俗称荧光染料， 是一种无色染料， 在紫外光的照射下， 可激发出蓝、 紫光，与基质上的黄色互补而具有增白的效果。但是长期使用会危害人体健康， 同时造成环境污染。荧光增白剂根据其化学结构主要可分为五类，分别是二苯乙烯型、香豆素型、吡唑啉型、萘酰亚胺型、苯并恶唑型，被广泛应用于造纸、纺织印染、洗涤、塑料等工业行业。一般地，荧光增白剂可以使用紫外灯照射观察法、白度法、紫外分光光度法、荧光分光光度法、薄层层析法、毛细管电泳法、高效液相色谱法和液相色谱-质谱联用法等进行测定。

近几年来，三维荧光光谱、同步荧光光谱等技术的使用进一步增强了对荧光增白剂的分析，图 5 表示了四种荧光增白剂的同步荧光光谱， Δλ=50 nm 时，四种物质在 360 nm 处均有较好的荧光特性[9]。

由于人类生产生活过程中大量使用洗涤用品， 导致生活污水中荧光增白剂的含量逐渐上升，因而可以用荧光增白剂来表征生活污水。 Takahashi [11]和 Bridgeman[12]等人在运用荧光光谱分析荧光增白剂时，均发现荧光增白剂可以用来表征生活污水的污染。此外，荧光增白剂也可以作为人类排泄物污染的特征污染物之一[10]。 Chandler[26]等人用紫外灯检测下水道中的荧光增白剂，并以此作为下水道错位的标志。 Graham[27]等使用手持式荧光探针结合三维荧光光谱技术分析测定了垃圾渗滤液中的荧光有机污染物， 发现荧光增白剂可以作为垃圾渗滤液的早期指标进行监测。

就荧光增白剂的定量化而言，一般可以利用荧光光谱技术与其他方法联合进行分析。除此之外，一些新型的检测方法也逐渐应用到研究当中。于洋[28]等使用自行研制的前表面荧光光谱技术分析了洗涤剂中的荧光增白剂，得到该方法检测限为 2.8 μg•kg-1 ，线性范围为10.0-500.0 μg•kg-1，是一种新型高效的定量方法。唐容[29]等运用共振光散射光谱技术分析了荧光增白剂 VBL，发现其荧光强度与浓度具有良好的线性关系，该方法检出限为 0.33 mg•kg-1，线性范围 0-4.0mg•kg-1，也是一种高效快速的分析方法。

木质素是世界上含量最丰富的有机物之一，它和纤维素、半纤维素一起构成了植物的主体结构。根据单体的不同，木质素水解产物分为紫丁香基木质素、愈创木基木质素、对-羟基苯基木质素。木质素也是一种性能优越的天然高分子材料，经过改性处理之后，可以应用到许多方面，工业上可做合成树脂、橡胶等各类高聚物的添加剂、吸附剂，农业上可做植物生长刺激剂、农业肥料、土壤改良剂等。一般地，木质素及其衍生物可以使用气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、核磁共振法、近红外光谱表征法、紫外分光光度法等进行检测。

腐殖质是一类大分子难生物降解有机物，广泛存在于土壤、各类水体（河流、湖泊、海洋）和沉积物中，可以吸附多种污染物质。根据溶解度的不同，可以将其分为腐殖酸、富里酸、胡敏素。通常，可以采用紫外可见荧光光谱法、三维荧光光谱法、红外光谱法、核磁共振法、同步荧光光谱法等方法进行分析。

在腐殖质的荧光测定中，富里酸和腐殖酸是最常见的两类物质。表1中列出了富里酸和腐殖酸的特征峰位置，图6列出了三维荧光光谱图中腐殖质的荧光峰位置，其中区域Ⅲ、Ⅳ分别属于富里酸和腐殖酸[3]。

氨基酸是蛋白质的基本组成成分，广泛存在于河流、湖泊、海洋及沉积物中，而水体中的溶解态氨基酸是天然有机物的重要组成成分，可以被微生物利用。就氨基酸的检测方法而言，一般有高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法、液相色谱-质谱联用法、离子色谱法、紫外分光光度法、毛细管电泳法，同时荧光光谱技术也逐渐成为重要的检测手段之一。

在氨基酸的荧光光谱测定中，最常见的是色氨酸和酪氨酸，其特征荧光峰见于表1。 Li等[38, 39]通过区域荧光一体化研究了洞庭湖、洱海沉积物中的溶解有机物，其中色氨酸和酪氨酸的荧光区域与图6中Ⅰ、Ⅱ部分一致。

多环芳烃是一类由两个及两个以上苯环以稠环的形式组成的碳氢化合物， 具有致癌致畸致突变的作用，是许多国家和地区控制的首要污染物之一，广泛存在于土壤、大气和水环境中。多环芳烃的性质与其苯环数密切相关，相对而言，苯环数小于三的物质，易挥发，水溶性较好；苯环数大于三的物质则易与有机物结合。一般可以利用荧光光谱法、气相色谱法、高效液相色谱法、气相色谱-质谱联用法等方法进行测定。

由于多环芳烃类物质具有共轭键结构，因此具有良好的荧光特性，可以利用三维荧光光谱和同步荧光光谱等技术分析。在三维荧光光谱图的分析中，不同种类、不同浓度的多环芳烃所出现峰数和峰型是不同的，但是一般位于205～300 nm/305～390 nm的范围内。杨云[44]等人运用同步荧光光谱技术分析了10种多环芳烃标志峰，表2为最佳标志峰位置及其对应Δλ值[44]。

在许多工业生产过程中，都会产生多环芳烃类物质。 Cohen[45]等人运用三维荧光光谱技术结合平行因子分析方法分析了污水处理厂的水样，仅在Lachish污水处理厂发现了成分5，它在245,270,280 nm/384 nm和350,375 nm/402 nm处存在荧光峰， 这与类芘类物质的荧光峰相似。而该污水处理厂的来水中大约一半来自生产电子产品的Intel工厂，因此认为成分5与电子工业的排放有关。

荧光光谱技术不仅用于定性分析也用于定量分析。 Patra[20]等运用同步荧光光谱技术定量分析了胶束溶液中的多环芳烃，其中在混合种类为6、 7、 10的溶液中应用良好，除苯并[B]蒽的检出限为32.21 ng•mL-1外，其他17种物质检出限均位于0.055～12.97 ng•mL-1。 Yang[21]等人运用荧光光谱技术的四维数据集结合四维平行因子分析， 定量研究了腐殖质溶液中的菲、芘、蒽和芴，该方法所得光谱与对照光谱的相似度均高于0.998，且各种多环芳烃的回收率在100%-120%之间，因此可以利用此方法来定量分析溶液中的四种多环芳烃。

环境因子对废水中溶解

有机物荧光特征的影响

在废水溶解有机物的分析过程中，荧光强度与浓度、性质等密切相关，除此之外，环境中各种物理化学因子和其他物质也会对其荧光特性产生影响，如无机离子、 pH值、温度、光照和其他荧光类物质等。

由于废水溶解有机物的吸附性，无机离子可与其发生反应，使得荧光特性发生变化，同时溶解有机物荧光强度的增强或减弱与无机离子的种类、浓度有关。 Reynolds [46]等通过同步荧光光谱技术分析了铁、镍、铜等金属离子对生活污水中腐殖酸荧光特性的影响，发现荧光强度在0～3 mg•L-1的铜离子溶液和0～1 mg•L-1的铁、镍离子溶液中变化剧烈，荧光猝灭严重。 Elkins [23]等利用三维荧光光谱技术分析了铝、钙、铽等金属离子对富里酸溶液荧光强度的影响，在15 mg•L-1的富里酸溶液中，分别加入300 μmol•L-1的Al3+、 Ca2+、 Tb3+溶液，其中Al3+的加入使得富里酸特征峰荧光强度增加了42%， Ca2+的加入则变化不大， Tb3+的溶液则发生了荧光猝灭。

pH值的变化会改变分子构象，导致更多的荧光基团裸露或隐藏，进而改变荧光强度。一方面pH值可以影响物质特征峰的位置。梅毅[47]等运用三维荧光光谱技术及荧光偏振的方法研究pH值对类腐殖酸的影响，发现pH值对类腐殖酸的特征峰的位置漂移影响较大，而对类富里酸和类蛋白的特征峰影响较小。另一方面pH值会影响物质特征峰的荧光强度。Westerhoff [48] 等利用三维荧光光谱技术分析pH值对于富里酸标准品的影响，发现当pH值在3-7之间变化时，富里酸特征峰的最大荧光强度下降了30%-40%。易黎丽[49]等通过激发和发射光谱技术分析了pH值对含油废水特征峰的影响，酸性条件下，特征荧光峰的强度和位置均发生变化，但在碱性条件下只有荧光强度发生变化，因而利用pH校正补偿可以提高检测准确度。在城市生活污水二级出水中，类腐殖质特征峰荧光强度在酸性条件下随pH值的升高而降低，碱性条件反之[50]。

展望与建议

本文内容为录用首发版，定稿请参见《南水北调与水利科技》2018年第2期。

本期编辑： 阿丹、海超、檬檬               

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