蛋白桑: 桑叶多糖的研究进展

摘要: 目的 综述桑叶多糖的研究进展。方法 参考国内外相关文献，对桑叶多糖 的各方面研究进行了综述，包括桑叶多糖药理特点、桑叶总糖提取与分离纯化、桑 叶多糖组分分离纯化及其结构。结果与结论 桑叶多糖是桑叶中一类高分子化合 物，具有显著的药理活性，利用和开发前景广阔。桑叶多糖提取、分离和纯化工艺 比较复杂，其组分分离纯化、结构与活性关系值得进一步深入研究。 

关键词 桑叶多糖；多糖组分；药理作用；分离纯化；结构分析

桑叶为桑科植物桑（Morus alba L.）的干燥叶子，我国桑属植物有11个种，大 部分地区均有种植，每年桑叶产量达1000万吨，其中以浙江、江苏等南方养蚕地区 产量较大 。桑叶是我国传统中药，其药理活性最早记载于东汉时期的《神农本草经》，具有祛风清热、凉血明目、补益等功效，主治风热感冒、肺热燥咳、头晕头 疼、口渴、肺热咳嗽等病症。化学成分研究表明，桑叶含有丰富的多糖、蛋白质、 维生素、矿物质，还有黄酮及其苷类、生物碱、甾体、挥发油等活性物质 。由于桑叶黄酮及其苷类和桑叶生物碱属于小分子物质，利用传统色谱和波谱技术可以进 行提取分离与结构鉴定，所以对二者的研究报道比较多。而桑叶多糖作为一类天然 高分子化合物，分子量较大，分离纯化和结构鉴定复杂，所以对其研究特别是多糖 基金项目组分的分离和结构鉴定较少。本文根据国内外报道资料和作者科研经验，总结了桑 叶多糖的研究进展，以供参考。 

桑叶多糖的药理研究1.1 降血糖活性 现代药理学研究表明，桑叶多糖具有显著的降血糖作用 将桑叶中提取桑叶总多糖（total polysaccharide mulberryleaves，TPM）给四氧嘧啶造模 的糖尿病小鼠喂药，结果表明TMP对糖尿病小鼠糖代谢有调整作用，可提高糖尿病 小鼠的耐糖能力及糖的贮存能力，增加肝糖原含量而降低肝葡萄糖含量，促进正常 小鼠胰岛B细胞分泌胰岛素，在血糖水平下降的同时，明显提高了胰岛素水平。赵 利用桑叶多糖粗提物进行降血糖实验，结果表明桑叶多糖在浓度为200mg/kg时，给药4h后血糖浓度下降44.4%。夏伟等 通过蛋白酪氨酸磷酸酯酶PTP1B体外模型测试了一种桑叶酸性杂多糖SJB的降血糖活性，发现在SJB浓度为20 g/mL时抑制 率为31.7％，表明SJB具有一定的降血糖活性。此外，邢东旭等 通过试验比较，发现微波萃取桑叶多糖的降血糖效果好于热水浸提的桑叶多糖，尤其是微波提取的桑 叶多糖浓度为600mg/kg，糖尿病模型小鼠的血糖浓度极度显著降低。但目前桑叶多 糖防治糖尿病的研究还处于初步阶段，其确切活性成分、防治机理和构效关系还是 空白。 

1.2 抗氧化活性 邢东旭等 从纯化学模拟体系、化学模拟与原生质体复合体系对桑叶总糖的抗氧化活性进行了研究，结果表明桑叶总糖可以显著清除化学模拟体系产生的OH自 由基，对DPPH也表现出一定的清除作用，能显著降低H 诱导的小鼠肝脏MDA的形成和积累，并且在浓度低于20mg/L时，对H 诱导的红细胞氧化溶血有一定的抑制作用。杨青珍和王锋 采用水提法得到龙桑叶多糖，通过抗氧化试验发现龙桑叶多糖抗氧化能力较强，并且柠檬酸和抗坏血酸对龙桑叶多糖的抗氧化性具有协同增 效作用。 

桑叶总糖的提取2.1 热水浸提法 热水浸提桑叶多糖是传统方法，在提取之前进行桑叶组织破碎，再选择合适的 料液比、提取温度、提取时间等条件进行提取。沈爱英等通过正交试验，得到了 桑叶水溶性多糖的提取工艺：料液比1:25（g/mL）、提取温度75、提取2次、抽提 60min，桑叶多糖沉淀时乙醇体积分数80%，多糖得率为2.508%。刘咏采用水提 醇沉法提取桑叶多糖，通过正交试验得到最佳提取条件为：提取温度100、料液比 1:100、提取时间60min、提取液pH4，再通过Seveg法除蛋白和凝胶色谱纯化后，桑 叶多糖得率为98.52mg/g（dry weight, DW）。应芝等利用响应面法优化了桑叶多 糖提取工艺，得到最佳提取工艺条件，即提取温度77、料液比1:17、提取时间85min、 提取2次，最终桑叶多糖得率高达4.67%。热水浸提法优点为设备要求低、无污染、 安全，是一种最为常用的方法，然而，该方法需水量多，醇沉时乙醇用量大，提取 时间长、温度高对多糖结构具有一定的破坏作用。 

2.2 酶法提取 桑叶细胞壁组成有纤维素、半纤维素、木质素和果胶等，细胞膜组成还有蛋白 质。酶法提取是利用各种酶溶解细胞壁后，由于桑叶多糖向溶剂中扩散阻力减少， 所以更多的桑叶多糖溶出，从而得率增大。王芳和郑海雪考察了纤维素酶、果胶 酶和胰蛋白酶对桑叶多糖提取的影响，通过单因素试验确定酶法提取的较优工艺条 件为：酶用量1.5:100、料液比1:40、酶解温度50、酶解时间2h，最终桑叶多糖得 率为12.49％。酶法提取特点是桑叶多糖得率高，提取条件温和，但生产成本较高， 同时，酶的引入影响多糖的纯化。 

2.3 超声波辅助提取 利用超声波辅助提取桑叶多糖，其依据是超声波空化产生极大压力造成植物细 胞壁及整个组织的破裂，整个破裂过程在瞬间完成，提取时间短，有效成分的溶出 快，效率高。而且，超声波破碎过程是一个物理过程，浸提过程中无化学反应，被 浸提的生物活性物质在一定时间内保持不变。影响超声提取的因素很多，如超声波 功率、频率、料液比和提取次数等，必须通过试验优化才能获得最佳提取条件。赵通过正交实验比较热水法和超声波辅助法提取桑叶多糖，发现后者多糖得率 高，提取一次（30min）桑叶多糖得率为2.6658％。王丰俊等采用响应面法优化超 声波辅助提取桑叶多糖，确定最佳提取工艺条件为：提取温度81.5、超声时间 30min、超声功率100W、料液比1:10，桑叶多糖得率达2.99％。超声波辅助提取桑 叶多糖具有时间短、加热低、效率高等优点，但目前该方法仅限于实验室操作，大 规模工业化应用还有待进一步研究。

 2.4 超高压提取 超高压提取是在常温条件下对物料加压（大于100MPa），保持一定时间后突然 泄压，造成细胞内外压差急剧变化，细胞壁和细胞膜被充分破坏，使细胞中后含物 释放出来。凌庆枝等通过正交试验优化了超高压提取桑叶多糖的工艺条件，其最 佳条件为：超高压压力300MPa、保压时间4.5min、pH9.0、固液比1:16，最终桑叶多 糖得率达2.23％。超高压提取桑叶多糖不但可以大大降低能耗，而且可以减少杂质 成分的溶出，是一种高效提取方法。但同超声波提取一样，目前该方法只适宜实验 室应用，利用超高压工业化生产桑叶多糖还有待于研究。 桑叶总糖的分离纯化桑叶经水提取后得到颜色较深的桑叶多糖粗提液，其中含有大量的杂质，如蛋 白质、黄酮及其苷类、叶绿素、单糖、寡糖、生物碱等，所以制备高纯度桑叶总糖 必须将这些杂质尽可能除去。 

3.1 除蛋白 蛋白质是桑叶多糖粗提液中主要杂质，利用生物技术除蛋白质方法，如盐析法、 等电点沉淀法、加热变性法、有机溶剂变性萃取法、蛋白酶法等，可将桑叶多糖粗 体液中杂蛋白除去。但加热变性法和单一等电点不能完全除去蛋白，等电点沉淀法 要求操作精细，膜过滤法费用太高，同时降低了桑叶多糖回收率。从国内外报道来 看，在除桑叶粗提液中蛋白质有Sevag法和三氯乙酸（TCA）法。Sevag法是 采用-正丁醇（体积比3或4:1）混合溶液使桑叶多糖粗提液中游离蛋白质发 生变性，形成沉淀，再利用萃取方法除去蛋白质。Sevag法在避免多糖降解方面有较 好的效果，但效率低。三氯乙酸去除蛋白质是利用蛋白质在酸性条件下带正电荷与 三氯乙酸的酸根结合形成沉淀，从而离心去除蛋白质。欧阳臻等通过单因素实验， 确定10％三氯乙酸在与桑叶多糖粗提液体积比为1:12时，去除蛋白效果最佳。但该 方法需要控制三氯乙酸浓度、沉降温度等因素，否则会引起多糖的降解。张琳华等通过试验比较，发现TCA法去除蛋白质的效果优于Sevag法。 

3.2 脱色 桑叶多糖粗提液含有大量的色素，包括黄酮及其苷类、叶绿素、叶黄素等，利 用桑叶多糖和色素的理化特性差别进行脱色。目前，除去桑叶多糖粗提液中色素的 方法有大孔树脂吸附法、活性炭法和澄清剂法等。采用大孔吸附树脂进行纯化，操 作简便，环境污染小，价廉，可适用于工业生产。赵俊等发现AB-8大孔吸附树脂 除桑叶粗多糖色素效果优于树脂D-101，并建立其动态最佳纯化条件，即上样浓度 0.3g/mL（折合原材料）、流速1.5d/s、上样量240mL，树脂可重复使用3次。夏玮等通过工艺研究发现，使用AB-8树脂，在流速4.6BV（树脂床体积）/h、原料桑叶 总糖浓度3％、处理量5BV时，脱色率达82％。刘咏和金春雁等均以sevag法除 蛋白后的桑叶多糖粗提液为原料，采用活性炭去除色素。而作者通过研究比较，发 现活性炭脱色不仅脱色效果不理想，而且桑叶多糖回收率较低。此外，林江博等采用两种天然澄清剂（II型ZTC1+1）纯化桑叶粗多糖，通过正交试验得到其最佳纯 化工艺条件：原料浓度5mL/g、澄清剂A和B加入量分别为料液体积的1％、2％、絮 凝温度50，在此条件下，蛋白质去除率为16％，多糖回收率达96％。 桑叶多糖组分的分离纯化与结构桑叶总糖是一类高分子的杂多糖，具有多种组分，每一组分具有不同单糖种类 和化学结构，因此，深入研究桑叶多糖的化学结构及其降血糖活性，必须利用各种 现代色谱技术获得到高纯度桑叶多糖组分。多糖结构描述包括多糖分子量范围、多 糖中单糖组成、单糖连接点、单糖和糖苷键构型、重复单元等。目前，人们对桑叶 多糖的研究基本上处于确定单糖组成及其比例、糖苷键类型及其残基阶段，然而多 糖组分的整个结构完全确定还是空白。 根据各种桑叶多糖组分的特性，特别是带电荷数和分子量，利用离子交换树脂 和凝胶可进行分离，桑叶多糖分子量一般采用高效液相凝胶色谱、电泳或软电离质 谱（如MALIDA-TOF-MS）获得，其单糖组成采用化学降解（如盐酸水解）和气相 色谱（GC）联用技术确认，波谱技术如核磁共振（NMR）、傅立叶变换红外（FT-IR） 等确认部分桑叶多糖结构。 欧阳臻等以水提醇沉的桑叶多糖为原料，经TCA脱蛋白和乙醇分级后，利用 DEAE-纤维素和葡聚糖凝胶Sephadex G-100纯化得到三个桑叶多糖组分MP11、 MP12和MP13，利用糖腈乙酰化-GC分析方法，发现MP11由 Rha、Ara、Xyl、Man、 Glu、Gal组成，其比例为21:16:3:3:1:20，MP12由Rha和Glu组成，其比例为3:1，MP13 主要由Rha组成。盖英萍等 通过 Sephadex G-200柱层析检测，得到3种多糖组分（I， II，III），经Sephadex G-75柱层析测定三种多糖组分的相对分子量分别为41977、 21220、66970。张剑韵等研究发现，通过水提醇沉和Sephadex G-100凝胶层析可 直接得到三个桑叶多糖组分MPSI、MPSII、MPSIII，FT-IR分析表明MPSI不同于 MPSII、MPSIII，表现分子链、-糖苷键构型、含酰胺基团等特征；GC分析结果显 示，三种桑叶多糖组分主要含有L-Rha、D-Glu、D-Gal，其中D-Glu和D-Gal的构成 比例较大。吕庆等利用DEAE-纤维素和Sephacryl S-200凝胶色谱从桑叶多糖中纯化 三种组分SD2-3、SD3-3、SD3-4，通过高效凝胶渗透色谱分析确定为均一多糖，相 对分子量分别为6000、80000、10000左右，同时FT-IR分析表明三种糖组分含有糖醛 酸残基。Xia等采用DEAE-纤维素和Sephacryl S-200凝胶色谱分离纯化，从桑叶中 得到一种新型的粘性桑叶多糖SDA，GC-MS分析表明SDA的单糖组成为Rha、Ara、 Xyl、Glu、Gal、galacturonic acid，其摩尔比为5:4:1:2:6:38，MS和NMR分析结果表 明SDA主链由a-(1,4)-半乳糖醛酸组成，同时含有(1,2)-Rha残基，在主链O-3或O-2位 置连接支链，或在O-4位置与Rha残基的(1,2)位形成糖苷键，其中支链由(1,5)位相连 的阿拉伯聚糖、(1,3)位相连的鼠李聚糖、(1,4)位相连的木聚糖、(1,4)位相连的葡聚 糖和(1,2)位相连的半乳聚糖组成。 虽然我国有着丰富的桑叶资源，但是当前桑叶利用只限于养蚕和加工叶类药材，用途非常单一。近年来由于受国际金融危机的影响，我国丝绸加工业受到很大的冲 击，每年约有250万吨的桑叶浪费，所以桑叶资源的利用与开发势在必行。糖尿病是 一种常见的内分泌疾病，世界卫生组织已将它和肿瘤、心脑血管病一起列为世界范 围的三大难症，严重影响着人们的健康。目前，全世界糖尿病患者已达1.3亿，仅我 国就有4000万，而且每年新增患者150万，所以积极预防和治疗糖尿病已迫在眉睫。 随着人们对桑叶多糖提取纯化研究的深入，特别是高纯度桑叶多糖制取工艺、多糖 组分结构与生物活性关系研究，桑叶多糖的开发和应用必将成为桑叶资源利用的一 个重要途径。在回归自然的浪潮下，具有显著降血糖活性的桑叶多糖必将受到人们 的重视，利用现代提取分离技术和制剂技术开发降血糖药物和天然保健品必定具有 广阔的市场前景。

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