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蛋白桑:国外蚕业科学应用技术研究进展

饲料桑兴农 2019-02-10 14:58:36

 摘  要  进入 21 世纪 , 蚕业科学技术的研究在基 础研究 成果的 支持下 有较快的 发展 。 尤 其是利用 蚕丝和 桑叶的 功能 , 在医药卫生及其他领域的应用研究 , 展现出新的前 景 。 简述了 近几年 来以日 本为主 的蚕业科 学应用 技术研 究的重要进展 。 关键词  蚕业 ;应用技术 ; 家蚕品 种 ; 养蚕技术 ;桑品种 ; 综合利用 ;蚕生物反应器进入 21 世纪 , 蚕业科学技术研究在基础研究成 果支撑下有较快的发展 。 从全世界看 , 除了中国之 外 , 仍是日本在蚕业科学技术方面开展了多方面的研 究 , 取得了许多重要的成果 。 世界蚕丝主产国印度 、 巴西在蚕业应用技术方面主要依靠引进日本的技术 。 韩国的养蚕业虽然萎缩 , 但仍积极开展蚕业科学研 究 , 尤其是在蚕 、 桑综合利用方面取得重大成果 。 本文简述近几年来以日本为主的蚕业科学应用 技术研究重要进展 。 

1 家蚕品种选育 近 10年来 , 日本育成的家蚕新品种主要是不同用途的特征性蚕品种 , 目的是为生产高附加值 、 多样化的蚕丝提供具有特异茧丝质性状的原料茧 。 同 时 , 为了构筑 21 世纪新的蚕丝业 , 还进行了能够在医疗 、 工业领域应用的蚕品种选育 。 最近育成推广的细纤度蚕品 种有改良新曙光 ( 2. 44 d t e x ) 、白 银 ( 1. 78 d t e x ) 、N 7N O N F× 中 125 ( 黄茧 , 2. 44 d t e x ) 、N 7N O N F× 尼( 白茧 , 2. 33 d t e x ) 等; 粗纤 度 、多 丝量蚕 品种有 F N G 20 ×N 510 ( 4. 44 d t e x 以上 ) 等 。 据报道 , 细纤度蚕品种选育用的原始 亲本 “M K ”的茧丝长 2 000 m 、纤度 1. 44 d t e x ; 粗纤度蚕品种选育 用的原 始亲 本 “ 27 粗 ”的 茧丝纤 度 5. 56 ~ 6. 67 d t e x 。 山本等用白银和显性三眠蚕交配 获得三眠蚕品种 , 用激素可从该品种诱导出高比例的二眠蚕 , 茧丝纤度 0. 56 d t e x 。 近几年日本育成多个有色茧家蚕品种 , 如黄茧品种 “钟光 × 黄玉 ”推广使用较多 。 具有类黄酮色   702  蚕  业  科  学 2007; 33 ( 4)   素的绿茧品种 “P N G× P C G ” 、“彩色 ”在部分地区推 广 。 导入 “琉球 ”多蚕茧品种血缘再进行改良 , 育成 同宫茧率 30%的 N玉 、C 玉 2 个品种 , 在特制的蔟 上结茧 , 同宫茧达 80%, 以缫制双宫丝 。 作为资源 保存的蚕 品种绵 蚕的丝 也已 用来 纺织 丝绸 , 制作 外衣息, 通过图位克隆 ( m a p b a s e sc l o n i n g ) 获得蚕对 B m D N V 感染性和抵抗性基因 ( n s d 2) 。 感染性蚕品 种的该基因含有 14 个外显子 , 全长 18 k b 。 感染性 蚕品种之间在第 7内含子中有差异 , 但不影响表达 。 抵抗性蚕品种中 , 该基因第 5 -13 外显子缺失 ( 约 6 k b ) , 因而不能正常翻译 。 进一步研究表明 , 该基因 的表达产物是具有 2 处糖基化位点的 12 次穿膜型 膜蛋白质 。 家蚕浓核病毒对蚕的感染 , 可能就是通 过这种类似受体的蛋白质实现的 。 该研究已经申请 专利 。T a k a h a s h i 等 于 2007 年首次揭示了黄色茧形 成机制 。 黄色茧的茧 色来自桑叶中 的类胡萝卜素 ( c a r o t e n o i d ) , 黄茧品种的肠道有一种与桑叶中包含 的类胡萝卜素结合的蛋白质 ( C B P ) , 能和类胡萝卜 素结合 , 使类胡萝卜素被摄取进入血液 , 该蛋白质已 经被分离 。 黄茧蚕品种中 C B P 基因由 5 个外显 子和 4 个内含子组成 , 品种间在第 3 个内含子区有 含或不含反转录转座子系列的差异 , 但不影响 C B P 基因表达 。 白色茧蚕品种其 C B P 基因的第 2 外显 子缺失 , 不能表达 C B P , 并由于桑叶 中的类胡萝卜 素不能进入血液 , 因而结白茧 。 通过转基因技术将 C B P 基因转入白色茧蚕品种 , 由于 C B P 表达功能恢 复 , 因而结出黄茧 。 最近 , 利用裸蛹 ( N d ) 做亲本育成每头蚕分泌丝 胶 70 ~ 80 m g 的蚕品种 “丝胶希望 ( s e r i c i nh o p e ) ”, 再和普通品种杂交 , 由于 N d 是显性 , 所以杂交种只 分泌丝胶 。 该品种已 用于批量生产 大分子丝胶蛋 白质 。 

2  家蚕饲养技术 2. 1 省力化养蚕 日本从 20 世 纪 60 -70 年代研 制简易饲 育装 置 、条桑割取机 、 给桑台车 , 直到 2002 年前后已形成 适合于目前日本农家养蚕的技术体系 。 在这漫长的 研究过程中 , 技术指标几度修改 、降低 。 从 2003 年 最终建立的省力化养蚕技术体系看 , 以采用机械的 高效率桑园管理及条 桑收获运送 、广食性蚕品 种 、 1 ~ 4 龄或 1 ~ 3 龄人工饲料育 、 4 ~ 5 龄传送带式省 力饲育机械装置 、熟蚕促进剂自然上蔟及风洞式蔟 中保护装置等为主要技术环节 。 

2. 2 人工饲料及原蚕全龄人工饲料育 清水等于 2006 年研制出用新鲜桑叶制作人工 饲料的方法 。 该方法只用磨 碎机将桑叶打 碎就可 以 , 不需 要加热 烘干 , 营养 成分的 损失少 , 制 作成本低 。 原蚕全龄人工饲料育主要内容 : 原蚕用低成本 人工饲料的研制 , 适应人工饲料的蚕品种选育 , 适合 原蚕生长发育及产卵性的标准饲养技术 , 蚕种保护 处理技术 。 实施该项技术体系获得了无微粒子病的 蚕种 , 保证了养蚕生产安全用种 , 而且蚕种生产成本 也进一步降低 。 如 : 春蚕期饲养 “芙 1· 蓉 1”, 公斤 种茧生产成本 6 585 日元 。 饭冢等于 2003 年建立了蚕种 2 年长期保存方 法 。 产卵后经 25 ℃ 保护 60 d 后 , 在 20、 15、10、5 ℃ 中分别保存 5 d , 再在 0 ℃ 经过 10 d , 放入 2. 5 ℃冷 藏 368 d ; 然后在 5℃保护 90 d , 进行中间感温 ( 10 ℃, 2 d ; 15 ℃, 4 d ) ; 此后移入 0 ℃再冷藏 120 d 。加 上卵的催青日数 ( 15 d ) 和幼虫 、 蛹的经过 ( 40 d ) ,从 第 1 世代的孵化到第 2世代的孵化恰好是 2 年 。 供 试的 4 个杂交种的孵化率为 87. 6% ~ 90. 9%  。 大沼于 2003 年育成暗色斑限性的平衡致死系 统 “B L ” , 该系统雌蚕 W染色体持有第 2 染色体的 M l 1 l 2 P 片段和 Z 染色体的 + 、 + 片段 , Z 染色体持有 + 、l 2; 雄蚕 2 条 Z 染色体分别持有 l 1/ + l 2、 + l 1/ l 2 。 进一步用暗色斑限性 的平衡致死系统 “ B L ”雌 和育种材料 W7雄杂交 , 然后反复回交 W7 雄 ( 或回 交 W7 雌 ) , 将平衡致死基因导入 W7, 获得了致死基 因杂合系 L 1( l 1 / +l 2) 、L 2 (+l 1 /l 2) 。再用 L 1和 L 2 系雄分别与 B L 系雌交配 , 获得新的平衡致死系 , 并继续进行实用性状选择 。 育成的新 B L 系雌与实 用品种杂交原种 ( F 7· N t ) 杂交 , 组成夏秋蚕用一代 杂交种 ( 命名白金仔 , p l a t i n ab o y ) 。 农家饲养成绩 : 茧层率 26%, 茧丝长 1 264 m , 茧丝纤 度 2. 54 d t e x , [ 8] 解舒率 74%, 全龄经过 22 d 。 抗病品种选 育仅见于 对家蚕浓 核病毒 ( B m D N V ) 、家蚕 核 型多 角体 病 毒 ( B m N P V ) 抗 性方 面 。 如 , 细纤度蚕品种 “朦胧 ”、 多丝量蚕品种 “大成 ”就 兼具抗 D N V 特性 。 最近 , 利用家蚕全基因组解读信 。  

 2. 3  无菌养蚕 所谓的无菌 ( g e r mf r e e ) 养蚕 , 其实是限菌动物 饲养 ( g n o t o b i o t e ) 或限菌饲养 ( g n o t o b i o s i s ) 。 设计无 菌人工饲料的组成要在充分兼顾蛋白质 、碳水化合 物、 脂肪 、 维生素 、 无机盐 5 大要素平衡的基础上 , 使 饲料中水分含量接近桑叶 , 且采用蒸气灭菌等措施 。 人工饲料的标准组成 : 干 燥桑叶粉 32%, 脱脂大豆 粉 47%, 纤维素 12%, 氯 化胆碱 0. 2%, V C 1. 5%, 柠檬酸 2. 0%, 谷固醇 0. 4%, 其他微量成分 ( 含 V B 群) 1. 5%。 1 ~ 3 龄 饲料食下量约 占全龄的 3%, 4 龄占 7%, 5 龄占 90%。 生产上应按养蚕数量分别 制作 。 可采用专门机 械将饲料制成 平板状或波瓦 状 , 通过蒸煮灭菌制成无菌人工饲料 。 饲料成本每 公斤 200 日元 , 市售 700 ~ 1 500 日元种的钵栽株而育成 , 是二倍体与四倍体的混数体 , 果 实大 、丰 产 。 栽 植 第 2 年 平 均每 株 收 果 373 个 、 1 203 g 。 桑果中含花青甙 ( a n t h o c y a n i n ) 具有消除活性氧的作用 , 作为功能化食品有开发前途 。

 3 桑品种选育 日本的桑树育种目标主要是高产量 、高饲料价 值、 抗病虫害等 。 2001 年以后 , 桑树栽培技术改革 , 以机械收获为前提的适合于密植栽培的桑品种成为 主要目标 。 同时 , 随着桑叶作为健康食品应用及桑 果在食品上的应用 , 非饲料用途的桑品种选育也成 [ 1] 为新的需求 。 桑品种选育以适应温暖地区 1 年多次养蚕 、 全 年优质高产桑叶 、适合机械化收获为目标 , 2000 年 育成 “夏攀 ”并通过审定 。 该品种产叶量高 , 耐桑缩 叶细菌病 、 里白粉病 , 对萎缩病中等抗性 , 饲料价值 同新一之 , 适合小型条桑收割机收获 。 新育成的果桑品种 “拉拉桑 ”开花年限长 , 栽植 次年就可以收获果实 。 该品种的果实产量比原亲本 大唐桑高 30%, 最大果实超过 15 g 。 果桑品种白利 ( B r i x ) 果实中含糖 分 9% ~ 10%, 适于 制果酱 。 果 桑品种 “波朴桑 ”的果实酸味淡 , 适于作庭院果树鲜食用 , 果实大小 4 ~ 6 c m 、 果重 6 ~ 7 g 。 果桑 “F M R 01”由秋水仙碱处理诱导 “形新 ”品   704  蚕  业  科  学 2007; 33 ( 4)   大量糖分有吸湿作用而使粪便软化 , 因发酵产生的气体造成大肠蠕动 , 可改善便秘 。 

4  桑叶的功能及利用 4. 1 桑叶乳汁中的活性成分 K o n n o 等 发现桑叶对蓖麻蚕 、夜盗蛾等鳞翅 目昆虫有毒性 , 喂食几天内就死亡 。 但是 , 将桑叶切 碎 , 用水洗去白色乳液再喂食 , 幼虫能良好生长 。 人 工饲料中添加桑叶乳汁 , 饲喂蓖麻蚕有强的毒性 , 表 现出生长发育被抑制 。 由此表明桑叶乳汁对某些昆 虫具有毒性和抑制生长发育的活性 。 经分析 , 桑叶 乳汁中含有高浓度的类糖生物碱 , 包括 1, 4 二 脱氧 1, 4亚氨基 D 阿 拉伯糖醇 、 1脱 氧野尻霉素以及 1, 4二 脱氧 1 , 4亚氨基 D 核糖醇 。 这些类糖 生物碱 在一部分 桑树品 种中的 含量达 到乳汁 的 1. 5% ~ 2. 5%, 干质量的 8% ~ 18%。 用离子交换树脂柱层 析可以纯化这 些物质 。 类糖 生物碱在乳汁 中的浓 度 , 不同桑品种间有差异 。 栽培品种 “不知雪 ”、“市 平 ”的桑叶中类糖 生物碱浓度高 , 并且以 1, 4二脱 氧1, 4亚氨基 D 阿 拉伯糖醇为主 。 “一之 ”只含 有低浓度的 1脱 氧野尻霉素 。 1, 4二脱氧 1, 4亚氨基 D 阿拉伯糖醇和 1脱 氧野尻霉素等类糖生物碱对蓖麻蚕幼虫表现毒性 , 而对家蚕却完全没有毒性 。 桑叶乳汁 , 除含类糖生 物碱之外 , 可能还存在高分子的耐虫因子 ( 毒物 ) 。 植物乳汁是植物的耐虫机制之一 , 这种珍贵的生理 活性物质将为农药 、医疗或作物耐虫育种应用 。 桑 叶中可提 取的类 糖生物 碱约占 干质量 的 0. 1% ~ 0. 01%, 10 m g 产品市售价数万日元 。 

4. 2 抑制 α 葡 糖苷酶活性和肠道调节作用 已经证实桑叶抽提物对小肠中的消化酶 α 葡 糖苷酶有抑制作用 。 因此 , 饮用桑叶抽提物或桑茶 , 对控制进餐时或餐后的血糖是有效的辅助方法 。 据 调查 , 桑叶是 43 种草药 中对 α 葡 糖苷酶抑制活性 最强的 。 桑叶中含有的 α 葡 糖苷 酶抑制物使原本 在小肠被吸收的大量糖分 因大肠内细菌的 作用发 酵 , 产生许多有机酸 , 使肠液呈酸性 , 有害细菌不能 发育 , 乳酸菌 、二裂菌 ( b i f i d u s ) 的比例增加 , 从而起 到调整肠道微生物的作用 。 同时 , 大肠中未吸收的。 全龄给饵 2次 ( 1 龄 、 4龄各 1 次 , 饲养 2万头蚕 时第 1 次给饵 3. 6k g 、 第 2 次给饵 85 k g ) 或 3次 ( 1 龄 、4 龄 、 5龄各 1 次 ) 。 这种生产方式 , 可以按计划 每日生产目标数量的蚕茧 。 一般采取鲜茧缫丝 , 为 应对化蛹前来不及缫丝 , 设计了保存鲜茧 1 ~ 2 个月 的方法 。 低成本人工饲料无菌养蚕的蚕茧和生丝 , 不易发生黄变 , 色泽白 、光泽好 , 纤度细 , 练减率低 , 染色性好。 

4. 3  抑制人类免疫缺损病毒 ( H I V ) 感染 H I V 是引起人类免疫功能缺损的病毒 。 H I V 主 要感染在细胞免疫系统中起核心作用的 C D 4 阳性 淋巴球 ( 辅助 T 细胞 ) 。 桑叶中所含 1脱氧野尻霉 素 , 通过对糙面内质网中 α 葡 糖苷 酶 Ⅰ 、Ⅱ 的抑制 而阻碍糖蛋白的修饰 , 使复合寡糖的高级结构不能 形 成 , 糖蛋 白 的异 常 功能 表 达与 分 泌受 到抑 制 。 g p 120糖链在 H I V 感染时起着对 C D 4 受体的吸着 、 浸透作用 。 所以 , 1 脱 氧野尻霉素对 g p 120 糖链生 物合成的阻碍就减少了 H I V 的感染 。 

4. 4 促进胰岛素分泌 、降血压 、降低胆固醇 ( 预防 高血脂 ) 已证实桑叶中的含氮糖类化合物具有促进唾液 分泌的作用 。 唾液中存在促进胰岛素分泌的 P C 肽 因子 , 胰脏中有 P C 肽受体 。 桑叶中的含氮糖类化 合物促进唾液分泌血糖调节因子 , 可能成为新型糖 尿病治疗药物 。 桑叶成分中的 γ 氨 基酪酸 ( G A B A ) 具有抑制血 压的作用 。 另外还有报道说桑叶有改善脂肪代谢的 作用和较强的抑制胆固 醇上升的效果 。 给患高 血脂症的实验系兔食下桑叶抽提物 , 显微镜观察表 明 , 实验兔肝细胞滴状中性脂肪的沉积程度轻 , 不易 形成脂肪肝 。 用实验大鼠 、 小鼠测定的结果表明 , 桑 叶抽提物有改善肝功能的效果 。 主要表现在降低肝 脏的中性脂肪 , 服用 2%浓度的桑叶抽提物可将高 脂肪肝中的脂肪含量从 550 m g /g 降低到 180 m g /g , 降低肝脏谷 ( 氨酸 ) 草( 酰乙酸 ) 转氨酶 ( G O T ) 和谷 ( 氨酸 ) 丙( 酮酸 ) 转氨酶 ( G P T ) ( 自 190 U /L 降低到 90 U /L ) , 胆固醇自 68 m g /g 降低到 45 m g /g , 饲料 中添加 5%桑叶 粉饲喂 大鼠 , 16 周后 最低血 压从 19. 065 k P a 降低到 17. 065 k P a 。 人体从食 物摄取 的能 量 70%来自 糖分 营养 。 如前述 , 桑叶具有阻碍消化吸收糖分的 α 葡 糖苷酶 活性的作用 。 据全日本进行体重变化的调查 , 健康 成人不改变饮食成分 , 每餐前饮用一定量的桑茶 , 14 d 后 329 人中 54%的 人体重 减轻 。 又据 “读 卖新 闻 ”( 2000年 10月 19日 ) 报道 , 5 人参加试验 50 d , 每餐前饮用 1 颗桑叶茶胶囊 , 1 人体重无变化 , 4 人 体重减轻 1. 4k g 。 桑叶抽提物本身不诱发染色体异常 , 是安全性的物 质 。 但 桑 叶 抽 提 物 具 有 抑 制 变 异 原 物 质 ( M N N G 及过氧化氢 ) 诱发染色体异常的效果 , 对丝 裂霉素 C 诱发姐妹染色体交换也有抑制效果 ( 30% ~ 70 %) , 并且对乙基甲烷磺 酸盐诱发的巯 基鸟嘌 呤耐性突变也有抑制作用 。 所以 , 桑叶提取物对癌 症早期的 D N A 损伤可能有预防作用。

 4. 5 桑叶复合材料的功效 桑叶配合其他食品成分 , 可提高桑叶原来持有 的功能 , 例如桑叶抽提物中加入蜂胶制成的糖尿病 预防食品 “桑 p o l i s ”。 蜂胶 ( p r o p o l i s ) 是蜜蜂从树木 新芽 、 蕾、 树皮采取的树胶 、树液 、植物性色素 、香油 等物 , 加上蜜蜂本身的分泌液 、 蜂蜡等混合制成 。 蜂 胶的主要药理作用是 : 杀菌 、提高免疫功能 、抑制炎 症和接触性皮炎 、改善肝功能 、 保护脑 、 保护胰脏的 β细胞等 。 “桑 p o l i s ”用的蜂胶是巴西产蜂胶 , 采自 特定蜜源植物 , 这种植物具有强的消除自由基活性 。 在不降低活性的条件下将桑叶抽提物浓缩后 , 以一 定比例与巴西蜂胶混合 , 既不损害桑叶和蜂胶的各 种药理作用 , 又具有相辅相成的效果 。 目前 “桑 p o l i s ”已经作为糖尿病预防食品生产并市售 。 因产品 消除了蜂胶原有的刺激性气味和口味 , 而且没有蜂 胶原来的粘性 , 糖尿病患者可将其添加到自己喜欢 的饮料中 。 经过东京卫生病院等 6 所医院的临床试 验 , 饮用 “桑 p o l i s ” 1 ~ 2 个月 , 患者血糖值及糖化血 红蛋白 ( H b A 1c ) 得到改 善 , 胰岛 素水平上升 , 肝功 能改善 。 

5  蚕丝的功能及应用 5. 1 丝素的功能与利用 丝素在非衣料领域应用的研究很活跃 。 丝素蛋 白在化妆品 、 护髪制品 、食品等领域作为原材料已经 实用化 , 主要是利用丝素蛋白质所具有的特性 : 适度 的吸湿 、 放湿性 , 富有光泽 , 吸收紫外线 , 优良的染色 性 , 活体亲和性等 。 同时 , 丝素蛋白质作为面向医药 的生物材料研究以及通过化学修饰增加丝素蛋白质 新功能的研究报道也很多 。 丝素溶于高浓度盐溶液 , 经透析脱盐成为丝素 水溶液 。 水溶液的丝素可以加工成粉末 、 凝胶 、 水凝 胶 、海绵体 、 膜等形态的材料 。 由于整个成材过程不 使用有害溶媒 、 交联剂等 , 是有利于环境保护的无公 害 、无毒天然材料 。 T a m a d a 将丝素和丝胶同氯磺酸 · 吡啶混合物。陆瑞好等 : 国外蚕业科学 应用技术研究进展;反应而硫酸化 , 制成硫酸化的丝素和丝胶 。 调查 它们对人全血的抗凝血作用 , 两者都能够延长血凝 时间 。 说明硫酸化的化学修饰给蚕丝蛋白质带来抗 凝血活性 。 另外 , 还发 现硫 酸化 的丝 素能提 高被 H I V ( 人免疫缺损病毒 ) 感染细胞的生存率 , 并且添 加多 量的 硫酸 化 丝素 对正 常 T 细 胞完 全没 有影 响。发免受外界因素的伤害 , 还能够改善头发的光泽与 弹性 。 同时 , 由于丝胶的保湿性 、抗静电性 、 保型性 以及对紫外线的吸收能力 , 有利于保护头发的健康 与美观 。 Z h a o r i g e t s u 等 通过小鼠 皮肤癌变 模式 系统 的实验证实 , 丝胶有抑制皮肤癌的效果 。 在用致癌 物二甲基苯丙蒽 ( D M B A ) 诱发 、 用 14 酰巴豆醇的乙 酸盐 ( T P A ) 做促进癌变剂的情况下 , 事前在皮肤的 同一位置涂布 5. 0m g 丝胶 的小鼠 , 16 周后发生肿 瘤的动物数只有对照区的 6%, 每头动物平均发生 肿瘤数只有对 照区的 1%以下 。 进一步 的检 测表 明 , 丝胶涂布小鼠真皮细胞中因 T P A D M B A 处理引 起的肿瘤坏死因子 T N F α 蛋白质的表达被抑制 。 S a s a k i 等。 糖链与活体内各种分子识别机制密切相关 。 已经成功地通过化学修饰使丝素附加 N 乙酰基 壳 寡糖或乳糖 , 后者具有与胶原蛋白相同的良好的肝 细胞附着性 。 在增加丝素的骨亲和性 、血液亲和性 方面也获得初步成效 。 将具有骨亲和性的含有磷酸 基团的 2 甲基丙烯酰基磷酸 ( M O E P ) 单体接枝聚合 在丝素中 , 使接枝聚合后的丝素能很快与磷灰石成 分构成复合体 , 将其埋植在大鼠大腿骨 , 骨结合性显 著增强 。 现正利用蚕丝的强度 、 弹性及活体亲和性 制作人工腱和韧带 。 2甲 基丙烯酰基氧乙基磷酸胆 碱( M P C ) 与丝素接枝聚合 , 在接枝聚合率为 1% ~ 2%时 , 接枝聚合的丝 素能显著抑制 血小板的附着 ( 血小板附着是产生血栓的起因 ) , 有希望用作人工血管的材料 。 由于基因操作技术的发展 , 已经有可能从基因 水平进行蛋白质的分子设计与生产 。 目前一些实验 室正努力进行将家蚕丝和蓖麻蚕丝 、蜘蛛丝 、 粘连蛋 白基序 、 弹性蛋白基序等相组合的新功能蚕丝材料 的设计与生产将丝胶以 1. 5%丝胶 +21. 5%酪蛋 白 、3. 0% 丝胶 + 20. 0%酪蛋白的比例加入饲料喂养 小鼠 , 对照为 23. 0% 酪蛋白 。 给小鼠注射致癌剂 1, 2二 甲基肼 , 饲养 5 周后 , 调查大肠发生前癌病变指 标畸变小囊病 灶 ( A C F ) 的数量 与面积 。 与 对照相 比 , 饲料中含 1. 5%、 3. 0%丝胶的小鼠其畸 变小囊 病灶分别减少 20%、 40%, 表现出显著抑制大肠癌 发生的效果 。 而且 , 随着饲料中丝胶量的增加 , 抑制 效果更好 。 据报道 , 给大鼠喂食含 3%丝胶的饲料 , 大鼠对 铁 、锌 、 镁、 钙的吸收显著增加 ( 20 % ~ 40 %) 。 常用 的药物往往增加对某种矿物质的吸收但又抑制另外 一种矿物质的吸收 。 丝胶却能同时促进对多种矿物质的吸收 。 已知丝胶覆在培养基的表面或涂层 , 能够促进 成纤细胞的增殖 。 据报道 , 采用无血清培养基的杂 交瘤细胞培养细胞系 , 培养基中添加丝胶有显著促 进细胞增殖的作用 , 其效果与牛血清白蛋白 ( B S A ) 相同 。 添加丝胶的培养基即使经过高压蒸汽灭菌也 表现同样效果 。T a k a h a s h i 等 在昆虫培养细胞 S f 9 的培养基中添加丝胶 , 可 以阻止血清饥 饿情况 下引起的细胞死亡和激发细胞生长 。 对照区血清饥 饿状 态 延 续 5 d 后 的 细 胞 生 存 率 为 20%, 添 加 0. 3%丝胶的细胞生存率约 60%, 添加 0. 3%牛血清白蛋白的细胞生存率约 80 % 。 近几年国外许多实验室研究 用丝胶处理棉纤 维 、合成纤维 。 经过丝胶涂层的纤维 ( 聚酯纤维 、 尼龙棉纤维等 ) 和织物 , 因纤维外层被覆丝胶 , 可以 避免化学纤维直接接触皮肤 , 从而减少化学纤维对。 

5. 2  丝胶的功能与利用 丝胶蛋白质持有羟基的氨基酸含量多 , 如丝氨 酸、 苏氨酸共占 40%, 因此保水 、 保湿性好 。 丝胶的 氨基酸组成和人类皮肤中的天然 保湿因子 ( N M F ) 的游离氨基酸组成相似 。 丝胶蛋白的分子构象主要 是无规卷曲 , 空间结构松散 。 丝胶多肽链表面有许 多亲水基团 ( —O H ,—C O O H ,—N H , 这些亲水基 2) 团同人体内传至皮肤角质层的水分结合 , 使皮肤保 持适度的水分 , 防止皮肤干燥 、起皱 、糙裂 。 丝胶有 较强的抗氧化作用 , 实验表明 , 丝胶对亚油酸过氧化 的抑制效果相当 于牛血清蛋 白的 80% ~ 90%。 最终浓度 0. 5%或 1. 0%的丝胶能显著抑制酪氨酸 酶活性 ( 分别降低到 76%和 50%) 。 丝胶抑制酪氨 酸酶活性 , 也就抑制了黑色素合成系统的活动 , 减少 黑色素积累 , 起到美白皮肤的作用 。 丝胶对头发有很好的亲和性 。 丝胶溶液能够在 头发表面形成一层保护性的透明薄膜 。 不仅保护头   706  蚕  业  科  学 2007; 33 ( 4)   皮肤的刺激 。 如用丝胶涂层的聚酯纤维与未经涂层 的相比 , 在 40 ℃、R H 90%条件下放置 2 h , 标准吸 湿率提高 9 倍以上 。 据报道 , 日本大阪回生病院临 床测试丝胶涂层织物作内衣使用的效果表明 , 使用 丝胶涂层 织物 , 接触 过敏性 皮炎 的症 状大幅 度减 轻尿酸也有强的抗氧化能力 , 也是人类皮肤角质层中 天然保湿因子的成分之一 。 茧层游离氨基酸含有多 量天然保湿因子的主要成分 。 茧层矿物质钙 、钾等 能促进皮肤角质层细胞代谢旺盛 。 可以说 , 淡绿色 茧茧层抽提物是理想的化妆品 、 护肤品原料 。 

5. 3  淡绿色茧茧层抽提物的功能与利用 栗罔 、 山崎等研究发现 , 淡绿色茧的茧层具有强 的消除自由基作用 , 即抗氧化活性。 以大造 、 淡绿色茧 、黄色茧 、白 色茧分别制备 茧层热水抽提 物 , 比较它们的抗氧化活性 。 大造茧层抽提物的抗 氧化活性比白色茧高 10 倍以上 。 包括大造在内的 淡绿色茧 , 其茧层 抽提物 消除二 苯基苦 基肼 ( D P P H ) 自由基的能力和抗过氧化物生成的能力 , 为常 用抗氧化剂维生素 E 的 1 倍以上 。 进一步用 70% 乙醇从大造茧层抽提物中分离出 3′ , 4′ , 3 , 5, 7五羟 黄酮 7 O βD 葡 萄糖苷 ( 约占 34. 8%) 、4′ , 5, 7三羟 黄酮醇 7O βD 葡萄糖苷 ( 约占 27. 5%) 等 7 种黄 酮醇和糖基黄酮醇 。 这些糖基黄酮醇和桑叶中所含 的糖基黄酮醇在化学结构上不同 , 可能是在家蚕体 内合成的 。 淡绿色茧 茧层中的黄绿色成分是类黄酮醇物 质 。 已知类黄酮醇物质是具有多种生理保健功能的 重要物质 , 如 : 抗氧化 、抗肿瘤 、降低胆固醇 、抑制酶 活性等 。 淡绿色茧茧层中的黄酮醇具有强的抗氧化 能力和抑制酪氨酸酶的作用 , 既保护皮肤避免氧化 反应造成的损害 , 对皮肤还有美白作用 。 茧层所含 , 从丝腺和蚕丝得 到胶原蛋白前体与丝 素 L 链的融合蛋白 。 但全长 胶原蛋白基因导入蚕 , 用蚕生产具有特殊功能的胶 原蛋白尚未见报道 。 Y a m a d a 等在 S e r 1 基因上游区域插入猫的干扰 素基因 , 通过显微注射获得导入了猫干扰素基因的 转基因蚕 。 猫干扰素基因在中部丝腺表达 , 检测 证实转基因蚕的茧丝具有抗病毒活性 。 但产量还不 够高 , 有待在启动子方面进行改进 。 与已知抗菌素作用不同 , 家蚕和独角仙的抗菌 蛋白质是以细菌细胞膜为靶 , 破坏膜结构物理性质 , 使膜上开孔而杀死细 菌 , 产生 耐性菌的可能性 小 。 利用 S e r 1 基因启动子 , 以转座子作载体 , 获得防卫素转基因蚕 。 检测表明 , 防卫素在中部丝腺表达 , 但量尚少 , 目前正对启动子做改良 。 此外 , 还利用丝胶茧突变品种 ( N d S , 只合成丝 胶 , 基本上不合成丝素 ) 作宿主 , 获得绿色荧光蛋白 质( G F P ) 转基因蚕 。 从其后代中部丝腺能够分离到 G F P 。 预期这个方法能用于后部丝腺难分泌的胶原 蛋白或膜蛋白之类的生产 。 

6  家蚕生物反应器之一 — — — 转基因蚕 T a m u r a 等开发了用 3X P 3 启动子作标 记基因 、 在眼和神经系统表达的转基因系统 , 目的基因 E G F P ( 增强的绿色荧光蛋白质 ) 在胚胎 、幼虫单眼 、成 虫复眼表达。 最近 , 采用不损害原有纤维或织物风格的方 法将丝胶涂层或固定在各种纤维表面 , 能够耐受 50 次以上洗涤仍保持丝胶涂层 。 丝胶的 5 种主 要蛋白质都有共同的富含丝氨 酸、 由 38 个氨基酸残基组成的特征性重复单位重复 12 次以上的重复序列区域 。 辻本设计了由上述 38 个氨基酸残基序列重复 2次组成的 76 肽密码 , 依此 人工合成 76 肽基因并在大肠杆菌中表达合成了该 76 肽 。 用荧光显微镜可以观察 , 筛选转基 因个体方便 。 同时 , 还改进了显微注射蚕卵的方法 。 在 3X P 3 实验中 , 注射 1 300 粒卵 , 约 40%孵化 、 生长 发育为成虫 , 相互交配得到 225 蛾区次代卵 。 其中 36 蛾区 ( 占 16%) 含有转基因蚕 。 熟练者每小时注 射 200 粒卵 , 每天可注射 1 300粒卵 。 在 G A L 4 /U A S 的实 验 中 , 注 射 1 502 粒 卵 , 孵 化 400 粒 ( 占 26. 6%) , 得到成虫 268 头 , 次代卵 112 蛾区中有 8 个阳性蛾区 ( 转基因蛾区 ) , 占 2. 1%。 I m a m u r a 等 利用酵母的转录控制因子 G A L 4 和它的靶序列 U A S , 据说能够控制转基因蚕中目的 基因在各组织或特定组织中表达 。 如 , 用 A 3 启动 子时可以在全身表达 , 用 3X P 3 启 动子时只在单眼 和复眼表达 , 用 f i b L 链启 动子时只 在后部丝 腺表 达等 。 胶原蛋白由于组织亲和性好 , 已经用在组织培 养和药物施用 方面 。 市售胶 原蛋白是从牛 皮抽取 的 , 由于担心可能混入能感染人的病原物而引起过 敏症之类的问题而受到拒绝 , 而用微生物 、 动物表达 尚未成功 。 T o m i t a 等将人 胶原蛋白 基因部分 序列 ( m i n i c o l l a g e n ) 导入蚕表达成功。 调 查 了 精 制 的 该 76 肽 对 乳 酸 脱氢 酶 ( L D H ) 由冷冻 融解而失活的保护作用 。 L D H对冷 冻敏感 , 在液氮中反复冷冻 1 m i n 、30 ℃ 融解 5 m i n , 活性显著降低 。 不添加冷冻保护剂时 , 5 次重复处 理 , 残留活性在 10%以下 。 添加上述丝胶肽 , 5 次重 复处理 , 残留活性在 90%以上 。 可见丝胶肽有佷好 的冷冻保护作用 , 与常用冷冻保护剂牛血清白蛋白 相媲美 。 

7 家蚕生物反应器之二 — — — B mN P V载体 蚕表 达系统   这方面的研究到 2005 年已经基本解决了自重 组病毒感染蚕到将蚕体内生产的蛋白质回收为止整个过程中的主要技术 , 达到实用化的要求 。 一般经 口接 种重组 病毒 N P V , 蚕儿 几乎 不感 染 。 采用多氧菌素 ( p o l y o x i n s ) 等促进感染药剂 , 制 成含 0. 5%该药剂的人工饲 料喂蚕 , 经口接种重组 病毒就很顺利达到 100%的蚕感染 。 经皮接种每分 钟 50 头蚕 , 每头蚕 5 μ L 病毒液 , 可 100% 感染 。 已 经研制出经皮接种的简易微量注射装置 。 原来从接种蚕血液收集表达的蛋白质 , 需要逐 头剪开腹足 、 放出血液 。 为了提高生物反应器的生 产效率 , 研制出用 C O 2激光器 产生的红外激光沿 8 ~ 10 体节正中线直线切开外皮 11 ~ 12 m m , 体液从 切口喷出 , 流入自动收集血液的装置 。 其后又研制 出冷冻融解血液采取法 : 将接种病毒后 4 ~ 5 d 的 5 龄蚕投入 0 ℃水中 , 5 ~ 7 s 后蚕体僵直呈棒状 , 移入 20 ~ 30 ℃的乙醇液进行冷冻处理 ; 冷冻的蚕放 入缓冲液中 , 利用冷冻幼虫融解时身体收缩的现象 , 用激光切开表皮或腹足收集血液 ; 用新研制的分光 光度计自动计测系统和软件测定血液回收程度 。 最 近 , 又研制出多关节机器手代替人工进行被接种蚕 的给饵 、 饲养 、 血液回收的自动化封闭系统 , 使生产 过程向无公害安全系统跨进一步 糖蛋白在 N 型 糖链的结构上不同 。 糖链具有使糖 蛋白与细胞结合等重要生理活性 。 如果 B m N P V 蚕 系统不能在它生产的蛋白质上附加哺乳类型糖链 , 其用途就受到很大限制 。 M o r i 等同时采用 A c N P V 、 转座子 p i g g y B a c 和转 基 因蚕 技术 , 将 哺乳 动物 的 β 1 , 4半 乳 糖 苷基 转 移酶 基 因 插入 重 组 病毒 A c N P V , 与辅助病毒一起注射蚕卵 。 获得的转基因 蚕血液中表达的目的蛋白质附加了 N型乙酰氨基 葡糖和半乳糖 。 这为生产流感病毒膜蛋白之类具有 复合型糖链的蛋白质作为疫苗使用带来希望 。 另外 , 利用人工合成的保幼激素类似物涂布 4 龄蚕表皮 , 获得 6 龄蚕 。 6 龄起蚕 再用保幼激素类 似物处理 , 可连续食饵 2 周 , 蚕体大 , 每头蚕可取血 液 1. 5m L ( 普通 5 龄蚕每头取血液 0. 5m L ) , 期望 用于 B m N P V 蚕 表达系统 , 提高生产效率 。 采血后的幼虫尸体 , 用干燥装置和选别装置按 丝腺 、 表皮 、 残渣分为 3 份 , 分别回收 。 干燥后蚕尸 骸质量减 少为 原来 的 1 /5。 1 万 头蚕 可回 收表 皮 1. 65 k g 。 羽 贺利 用 取血 后 的幼 虫尸 骸 收集 几 丁质 。 通过化学修饰成为二丁酰基几丁质 , 在过氯 酸存在下以无水酪酸做溶媒将几丁质酯化 。 二丁酰 基几丁质通过油 / 水乳浊液 蒸发溶媒 , 得到粒径 20 ~ 50 μ m 、 形状 大体均匀的微 细粒子 ( m i c r o s h e r e ) 。 根据几丁质的生物降解性带来的缓释效果 , 成功应 用于药物缓释系统 , 如支气管扩张剂茶碱 ( 1, 3二甲 基黄嘌呤 ) 。 将茶 碱与二丁酰基几丁质混合 , 制成 球形微细粒子 。 粒子直径越小 、 药物释放越快 , 在中 性条件下使用效果好 。 经改进后的 “B m N P V 载体 蚕表达系统 ”包括重 组病 毒 载 体 构 建 、专 用 蚕 品 种 选 定 ( 如 N L S 1 × C L S 1) 、 人工饲料配制 、饲育法与饲育装置 、病毒接 种法 、 血液采取法及装置 、目的蛋白质回收与纯化 、 重组病毒的灭活与封藏 、废弃物处理与利用等 。 在 日本已可以委托 片仓株式会社利用该系统 ( s u p e r w o r m , 超虫 ) 进行目的蛋白质的生产 。 2003 年日本 用“B m N P V 载体 蚕 表达系统 ”生产的猫干扰素 ( i n t e r c a t ) 产值 13亿日元 。 2005年 , 针对狗皮肤病发生 最多的接触过敏性皮炎的治疗药物 “狗干扰素 ( i n t e r d o g ) ”也已商品化。 最近 , 大浦等建立了可以一次饲养 2 万头 5 龄蚕规模 、 由微机管理的全 自动无人饲育体 系 , 包 括饲养环境调节 、 生长发育和行为观测 、 给饵 、蚕的 回收等全部实行自动化和微机管理 。 最大的好处是 能够防止外界微生物 ( 杂菌 、 病毒等 ) 进入饲育室 。 哺乳动物细胞合成的糖蛋白与昆虫细胞制造的 。

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