糖基化是在糖基转移酶的控制下，蛋白质附加上糖的过程，是一种重要的翻译后修饰。这种修饰对于蛋白质功能调节起着重要作用。研究表明，糖基化在许多疾病和生理过程中都起着关键作用，例如癌症、心脑血管疾病、免疫识别及信号转导过程。然而，糖基化位点上糖型的多样性以及翻译后修饰产物的极低丰度严重阻碍了糖基化的研究进程。在糖基化质谱研究应用中，天然多糖离子化效率较低也给质谱分析带来很大难度。同时，天然多糖通用标准品的缺乏，使多糖的定量分析也一直颇具挑战。美国威斯康星大学的李灵军教授团队通过利用赛默飞六通道aminoxyTMT质谱标记试剂结合Orbitrap Fusion Lumos液质联用，首次实现了靶向同步分离裂解多个离子的三级串联质谱（Targeted MultiNotch MS3）方法在N-糖组学的应用，为蛋白质糖基化研究乃至生命医学和疾病治疗等提供了新的研究方法和手段。
AminoxyTMT是赛默飞公司近年来推出的基于碰撞碎裂二级质谱产生的报告离子强度进行相对定量的六通道醛基衍生化试剂。衍生化可以显著提高多糖在电喷雾过程中的离子化效率，进而提高检测灵敏度；然而实际应用中，对于衍生化后的复杂型多糖和含唾液酸的酸性多糖， aminoxyTMT标记试剂的报告离子在碰撞诱导解离（CID）中生成效率较低，影响了复杂多糖定量的灵敏度和准确性。在液质联用进行复杂的实际样品分析过程中，母离子筛选易受基质的干扰，从而使得碰撞诱导解离二级质谱产生的碎片报告离子不完全来源于同一种母离子，定量结果与真实值存在偏差。为了克服这些局限性，作者利用了所有N-glycan分子的还原端结构中含有(HexNAc)2(Man)3 的共性，以及aminxoyTMT衍生化后的糖原分子在碰撞诱导解离后会产生一系列带有aminoxyTMT衍生基团的Y离子，巧妙地设计了同步分离并高能诱导裂解多个Y离子的三级质谱方法来生成用于相对定量的报告离子。这一方法在融合了三种质量分析仪（四极杆、线性离子阱、轨道离子阱）的赛默飞Orbitrap Fusion Lumos质谱仪上得以实现：第一步通过高分辨率的一级轨道离子阱质谱 （Orbitrap-MS）得到精确的母离子分子量，第二步通过四极杆分离目标母离子、线性离子阱中碰撞诱导碎裂二级质谱鉴定糖原单体成分，第三步通过离子阱中多个Y离子同步分离、高能碰撞诱导解离（HCD）、轨道阱检测的三级质谱得到报告分子基团以进行相对强度定量。在液质联用的在线检测过程中，作者利用二级质谱谱图中Y1（HexNAc-aminoxyTMT） 特征离子的存在来判断母离子是否为检测目标的糖原分子，并以此决定是否进一步对此母离子进行三级质谱定量分析：如果MS2 碎片离子中出现多糖的特征Y1离子，则利用线性离子阱同步分离出二级质谱产生的强度最高的5个碎片Y离子，并进一步高能碰撞诱导解离（HCD）这些Y离子来生成报告离子进行相对定量。在这个方法中，挑选多个碎片离子同时碎裂 （Multi-notch MS3），既保证了较高的报告离子强度，有利于对低丰度物种的定量分析，又降低了基质对母离子筛选产生的干扰，使得定量结果显著优于传统MS2方法。这一巧妙的设计，克服了aminoxyTMT在复杂多糖分析中报告离子生成的不足，提高了在线检测获得的有意义的图谱数量, 多糖的鉴定数，定量的准确性以及低丰度多糖定量分析的效率。
该文章同时就MultiNotch MS3的定量方法与传统HCD-MS2、以及标准MS3定量方法进行了比较。结果显示HCD-MS2 NCE 30能量的条件下报告离子生成效率低，定量结果与理论值也相距甚远；在提高能量到HCD NCE 70之后，MS2方法可以产生足够的报告离子，但是多糖的骨架碎片几乎全部消失，不利于多糖的结构鉴定。虽然标准MS3方法通过碎裂CID-MS2产生的Y1 离子可以得到丰富的报告离子与准确的定量结果，但是MultiNotch MS3定量方法可以通过筛选强度最高的5个Y离子进行再一次碎裂，获得高于标准MS3方法近九倍的报告离子强度，更准确的定量结果与更小的标准差，对于复杂多糖的分析，优势更为明显。文章最后，作者将MultiNotch MS3方法应用于牛甲状腺球蛋白与人血清蛋白多糖相对定量分析中，发现数种多糖在不同蛋白中的含量有较大差异，同时进一步验证了MultiNotch MS3定量分析结合aminoxyTMT可以提高低丰度多糖的定量效率。作者预见，随着高端质谱仪的普及，MultiNotch MS3的高通量相对定量方法在糖原组学分析领域和疾病生物标记物检测领域将会得到更广泛的应用。
这一成果近期发表在Analytical Chemistry 上，文章的第一作者是威斯康星大学麦迪逊分校博士生陈冰茗（现就职于默沙东公司）和博士后钟雪飞（现就职于华盛顿大学），通讯作者为李灵军教授。
该论文作者为：Bingming Chen, Xuefei Zhong, Yu Feng, Sergei Snovida, Meng Xu, John Rogers, Lingjun Li
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Targeted MultiNotch MS3 Approach for Relative Quantification of N-Glycans Using Multiplexed Carbonyl-Reactive Isobaric Tags
Anal. Chem., 2018, 90, 1129–1135, DOI: 10.1021/acs.analchem.7b03289
李灵军教授简介
李灵军，2000年于美国伊利诺伊大学香槟分校获得化学博士学位, 之后在美国太平洋西北国家实验室和布兰迪斯大学进行博士后研究。2002年起在美国威斯康星大学麦迪逊分校任教。现任威斯康星大学麦迪逊分校药学院和化学系双聘教授，获威斯康星大学Janis Apinis药物科学与化学教授和Vilas 杰出成就教授称号。
李灵军教授致力于生物分析科学以及质谱相关技术的研究, 主要涉及的领域有神经肽组学、蛋白质组学、代谢组学等, 并应用这些尖端的分析方法和技术解决神经生物学、基础和临床医学中的关键性问题。
李灵军课题组（已经毕业36位博士生，现有22位在读博士生，三位博士后）在生物分析化学领域的贡献主要在构建基于高灵敏度质谱多维分析平台, 并应用此平台于新型神经肽组学研究, 在高水平杂志上发表论文200多篇, 受邀学术报告180余场。李教授先后承担30多项科研项目, 获得研究经费超过两千五百万美元。
李教授先后被授予分析化学个人成就奖（匹兹堡会议）、美国国家科学基金委生涯奖、美国质谱学会研究奖、斯隆基金会研究奖, 以及2014 年Biemann Medal。2016年入选全球50位最有影响力女分析化学家。李教授还获得中国教育部“长江学者奖励计划”讲座教授称号。李灵军教授先后担任美国质谱学会教育委员会成员，Asilomar会议委员、 US HUPO 董事会成员，美国国家卫生研究院（NIH）基金评审委员会成员，美国国家自然科学（NSF）基金委员会，美国国家能源部（DOE）基金会，美国国家能源部环境分子科学实验室评审团成员，荷兰科学研究基金评审,马普合作基金评审，英国皇家化学学会Analytical Methods副主编，JASMS副主编，Analyst咨询委员会成员及美国华人质谱学会会长，并先后为60多个学术期刊担任评审。
李灵军
http://www.x-mol.com/university/faculty/80
课题组链接
https://pharmacy.wisc.edu/li-lab/
本文第一作者陈冰茗博士（右），钟雪飞博士（中）与李灵军教授（左）在CASMS（美国华人质谱学会）年度晚宴上合影
李灵军教授和她在美国威斯康星大学的研究团队
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