【泌尿生殖系统疾病】他克莫司稳定肾小球足细胞podocin蛋白表达分布进而抑制嘌呤霉素引起的足细胞损伤

2023-05-10 14:56:27

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作       者：谢清科　于力　于生友　郝志宏
通信作者：于力，Email：yuli828@yeah.net
作者单位： 510180 广州医科大学附属广州市第一人民医院儿科
本文刊发于 中华实用儿科临床杂志，2018，33(5):347-352.

摘要和关键词

摘要目的　观察他克莫司（Tacrolimus，FK506）及嘌呤霉素（Puromycin，PAN）对小鼠肾小球足细胞podocin蛋白表达和分布的影响，探讨FK506保护肾小球足细胞、影响蛋白尿产生的机制。方法　体外培养小鼠肾小球足细胞（MPC5），实验分为对照组、PAN组和FK506组。处理8 h、24 h和48 h后，观察并收集细胞进行实时荧光定量PCR、Western blot检测podocin mRNA及蛋白的表达，免疫荧光染色检测podocin蛋白的分布。结果　PAN组在8 h、24 h、48 h时胞体面积（6.41±0.22、4.96±0.09、3.76±0.16）较对照组（8.54±0.25、8.27±0.07、7.45±0.13）缩小。FK506组各时间点足细胞胞体面积（7.67±0.06、6.62±0.04、5.57±0.27）较PAN组增大。PAN组在8 h、24 h、48 h荧光定量PCR（0.63±0.12、0.56±0.01、0.48±0.02）、Western blot（0.71±0.03、0.46±0.01、0.34±0.02）及免疫荧光染色结果显示podocin mRNA表达量（1.22±0.15、1.18±0.06、0.87±0.30）较对照组下降，蛋白表达量（0.86±0.03、0.87±0.03、0.61±0.07）降低且分布异常，随着时间的延长mRNA和蛋白表达量明显降低（均P＜0.05），分布明显异常。FK506组在8 h、24 h、48 h 时podocin mRNA（0.87±0.15、0.78±0.15、0.58±0.12）及蛋白（0.82±0.02、0.62±0.03、0.50±0.02）的表达量较PAN组逐渐升高，分布趋于正常（P＜0.05）。结论　在PAN损伤足细胞的经典模型中，podocin mRNA及蛋白表达降低，FK506通过稳定podocin mRNA和蛋白的表达及分布来保护PAN诱导损伤的足细胞，该作用可能与FK506抑制蛋白尿产生及改善机制有关，可作为研究及治疗肾脏疾病的靶点。

关键词足细胞；他克莫司；嘌呤霉素；podocin


        肾病综合征 （nephrotic syndrome，NS）是一类以蛋白尿、低蛋白血症、水肿及高脂血症为主要临床表现的儿童常见肾脏疾病，由于其致病原因多样且治疗预后的不确定性受到越来越多的关注。肾小球足细胞损伤是各种肾脏病中蛋白尿产生的重要原因，其中主要原因为足细胞裂孔膜结构的破坏。研究发现，肾小球足细胞分子nephrin、podocin及CD2AP等标志蛋白的基因突变是造成机体蛋白尿的重要机制，但其具体致病机制仍不清楚［1］。同时，足细胞裂孔膜podocin和nephrin等标志蛋白会受各种因素的影响产生基因突变，这些蛋白的变异是狼疮性肾病、IgA肾病等众多肾病的重要致病原因，同时也会引起蛋白尿的产生，但podocin等蛋白引起这些疾病的具体机制仍不明确［2］，需要更多的动物细胞实验及临床验证。
        他克莫司（Tacrolimus，FK506）是一种钙调磷酸酶抑制剂（CNI），在临床上是治疗难治性肾病及各种器官移植的常用免疫抑制类药物。FK506的免疫抑制作用与环孢素类似，但其在肾病及脏器移植等疾病治疗过程中，免疫抑制作用较环孢素更高效，药物不良反应也更低。FK506的免疫抑制作用机制主要是抑制机体T淋巴细胞的活化与增殖［3］。本研究通过对小鼠肾小球足细胞实验，研究嘌呤霉素（PAN）对足细胞裂孔膜 podocin 蛋白表达与分布的影响和FK506对足细胞损伤的修复功能以及FK506对肾小球足细胞的作用及其机制，进而探讨FK506影响蛋白尿的机制，为临床FK506治疗肾脏病提供进一步的实验依据。
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材料与方法
1.1　足细胞培养　33 ℃，50 mL/L二氧化碳（CO2）诱导细胞增生，37 ℃培养14 d使足细胞分化，定期观察并换液，待传代细胞生长至80％~90％时接种至涂有 Ⅰ 型胶原的六孔板中（美国Corning 公司），倒置显微镜观察足细胞形态并拍摄照片。
1.2　实验分组　足细胞分化并铺板后分为3组：对照组、PAN组和FK506组。对照组采用纯1640培养液培养细胞；PAN组：0.05 μg/L的PAN的1640培养液培养细胞；FK506组：5 μmol/L FK506预处理2 h后加入含有0.05 μg/L的PAN的1640培养液培养。各组细胞处理8 h、24 h和48 h后，显微镜观察各时间点足细胞形态变化，并收集细胞用于各项实验。
1.3　实验方法
1.3.1　显微镜观察足细胞形态　从CO2培养箱中取出各组细胞，置于200倍的倒置显微镜下（德国Zeiss），分别观察各组在8 h、24 h和48 h足细胞的形态结构变化，运用Image J图像处理软件对各组足细胞胞体面积、足细胞数量、足突数量形态及细胞分布等形态进行分析。
1.3.2　实时荧光定量PCR　实验采用Trizol法，提取足细胞总RNA严格按Takara RNAiso Plus（日本TaKaRa公司）操作说明程序操作，提取的总RNA 浓度采用分光光度计（美国Thermo公司）测定，并计算相应的实验所需数据资料。根据PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser（日本TaKara公司）PCR反转录反应试剂盒说明书要求，计算各反应物添加剂量后去除DNA并反转录获取细胞总cDNA。GenBank查找小鼠podocin的mRNA序列，获取序列后由上海生工生物工程股份有限公司设计并合成引物，PCR引物序列如下：podocin蛋白正义链5′-GTAGTGGACGTGGACGAGGT-3′，反义链5′-TCTGGAGACGGAGATCAACC-3′，β-actin为内参，引物序列：正义链5′-TACCCCCAATGTGTCCGTC-3′，反义链5′-GCCCAAGATGCCCTTCAGT-3′。PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳（上海Beyotime Biotechnology 公司），采用Goldview 染色并扫描DNA 条带。
1.3.3　Western blot检测　用冷磷酸盐缓冲液（PBS）洗2次各组六孔板中的细胞，加入150 μL含蛋白酶及磷酸酶抑制剂的RIPA(Radio Immunoprecipitation Assay Lysis Buffer）裂解液（美国Thermo公司），置冰上裂解20 min，刮勺刮取收集细胞，离心10 min（10 000 r/min，离心半径10 cm），取上清，避免吸入沉淀，采用BCA（Bicinchoninic acid）法测定样品总蛋白浓度。调平后每个样品加入上样缓冲液，100 ℃水浴锅煮沸10 min使蛋白变性，冷却至室温后分装，置-80 ℃冰箱保存。每孔加20 μg总蛋白，80 V电泳20 min上层胶，然后调为110 V 1.5 h，转膜为湿转法，条件为300 mA电流，湿转 2 h。室温摇床封闭2 h，蛋白一抗稀释条件1∶2 000，洗膜3次后置于抗体孵育盒中4 ℃摇床孵育过夜，内参基因为β-actin，内参抗体按照抗体说明书进行稀释配置，二抗1∶10 000浓度稀释，洗膜后室温摇床孵育1 h，Tanon 5200（上海天能科技有限公司）化学发光成像系统曝光，曝光图片采用Image J图像分析软件分析。
1.3.4　免疫荧光染色法检测　培养细胞并爬片，采用冷丙酮固定10 min，固定后用PBS漂洗3遍，200 mL/L Triton X-100室温封闭10 min并用PBS漂洗3遍。对照组细胞爬片加入抗体稀释液，实验组细胞爬片加兔抗（sc-21009，美国Santa Cruz），4 ℃湿盒过夜。PBS洗涤3次后加二抗，稀释浓度为1∶200，室温反应2 h。采用荧光显微镜（德国Zeiss）拍摄荧光图片，运用Image J图像分析软件对免疫荧光图片进行分析。
1.4　统计学处理　应用SPSS 13.0统计学软件进行处理，计量资料采用x̄±s表示，2组间比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。
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结果
2.1　足细胞形态的变化　对照组足细胞的细胞核明显，胞体大，胞质丰富。足突量多，且结构明显，细胞间连接紧密。PAN组足细胞8 h时，胞体面积明显缩小（P<0.05），且足突结构可见回缩，细胞间连接较对照组细胞疏松；24 h和48 h时胞体面积明显缩小（P<0.05），足突结构回缩明显甚至消失断裂，细胞之间连接松散且分布散乱。FK506组足细胞胞体显著大于PAN组（P<0.05），细胞足突较PAN组丰富，细胞间连接紧密。见图1，表1。





2.2　podocin mRNA表达的变化　对照组正常足细胞分子podocin mRNA表达量在8 h时最高，24 h和48 hmRNA表达量逐渐下降。而PAN组较对照组足细胞分子podocin mRNA表达在各时间点均明显降低（P<0.05），8 h时podocin mRNA表达量下降，24 h和48 h时podocin mRNA表达量明显下降，随时间的延长表达量明显下降。FK506组较PAN组podocin mRNA表达量随时间的延长而明显上升（P<0.05）。PCR产物凝胶电泳可见特异性扩增的单一条带，条带清晰。见图2，表2。





2.3　podocin蛋白表达的变化　对照组正常足细胞分子podocin蛋白表达量在8 h时最高，24 h和48 h podocin蛋白表达量逐渐下降。PAN组与对照组比较，足细胞分子podocin蛋白表达在各时间点均明显降低（P<0.05），8 h时podocin蛋白的表达量降低（P<0.05），而24 h和48 h足细胞分子podocin蛋白表达量明显降低（P<0.01）；随时间的延长蛋白表达量明显下降。FK506组较PAN组podocin 蛋白表达量各时间点均有所升高（P<0.05），8 h时podocin蛋白表达提高（P<0.05），24 h和48 h时podocin 蛋白表达量均明显升高（P<0.05），见图3，表3。蛋白主要分布于细胞核膜及细胞胞膜表面，胞质间可见荧光染色分布均匀。PAN组8 h时蛋白分布主要呈点线状分布于细胞核膜，细胞质和细胞膜分布较少，24 h 及48 h时 podocin蛋白分布散乱甚至出现细胞膜、细胞质分布缺失。FK506组较PAN组在各个时间点podocin蛋白分布在细胞质的分布均趋于正常，而在细胞核膜及细胞膜podocin蛋白分布较PAN组有所改善，见图4。







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讨论
        NS好发于儿童，是以高度水肿、蛋白尿和低蛋白血症为主要临床表现的一类慢性肾小球疾病，自身免疫疾病、缺血损伤、药物及遗传等均是NS的致病因素［4-5］。蛋白尿是衡量局灶性节段性肾小球硬化（FSGS）、糖尿病肾病（diabetic nephropath，DN）及NS等众多肾脏疾病发生发展的重要标志，也是临床上评价治疗肾脏疾病效果的主要依据［6］。研究显示，蛋白尿的产生主要是受nephrin、podocin等足细胞裂孔蛋白影响，但其具体机制仍不明确［7］。足突上的裂孔膜是肾小球过滤的基本屏障，裂孔膜包括跨膜蛋白nephrin 和NEPH1，胞质衔接蛋白CD2AP 和 p85，离子通道TRPC6及抗增殖同源蛋白（PHB，prohibitin homology） podocin［8-9］，研究发现podocin及nephrin常在与裂孔膜结构上形成免疫复合物，从而共同发挥其正常的蛋白功能，podocin、nephrin等足细胞裂孔膜标志蛋白的表达及分布的调节对于足细胞稳态至关重要［10］。在众多肾脏疾病中，podocin是评估足细胞损伤及蛋白尿程度的标志蛋白［11-13］。
        在众多肾脏疾病中，NPHS1基因及NPHS2基因突变是引起肾脏病变的重要原因，基因研究发现NPHS1基因是nephrin蛋白的编码基因，NPHS2基因是肾小球足细胞标志蛋白podocin的编码基因，而NPHS2基因突变是NS、FSGS、IgA肾病等肾脏疾病的重要致病原因［6，14］。研究显示，IgA肾病中足细胞数量明显减少，而podocin蛋白转运的异常是造成IgA肾病的重要原因，因此podocin是IgA肾病进展的重要标志［15］。NPHS2基因的突变会造成肾脏FSGS疾病的发生及进展，其基因突变会造成裂孔膜蛋白之间相互作用的紊乱，进而对裂孔膜蛋白产生长期的交叉影响最终导致FSGS的发生［16-17］。
        FK506是20世纪80年代经过美国食品与药品管理局（FDA）认证的一种大环内酯类CNI，属于免疫抑制剂类药物［18-19］，临床上目前主要应用于各种脏器移植、多种NS及一些自身免疫性疾病的治疗［20］。FK506发挥免疫抑制作用的主要机制是通过与FK506亲免蛋白家族（FK506 binding proteins，FKBPS）中的FKBP-12蛋白结合，构成免疫蛋白复合物并降低白细胞介素（IL）-2的转运及活化，从而降低了 IL-2、IL-4、IL-5、干扰素（IFN）-γ及肿瘤坏死因子（TNF）-α的生成［21］。Qi等［22］研究发现，在糖尿病大鼠模型中，FK506能够抑制巨噬细胞活化，使足细胞podocin蛋白的表达量增加，保护足细胞形态结构正常，避免足细胞损伤，进而降低蛋白尿的发生。Jahan等［23］发现，FK506能够通过稳定足细胞相关蛋白进而保护肾脏，避免肾损伤，抑制蛋白尿的产生，是临床上治疗频复发型NS及难治性NS的常用免疫抑制剂。同时研究表明，FK506能够显著改善阿霉素大鼠肾组织病理变化并减轻尿蛋白，恢复足细胞podocin蛋白的表达，从而避免足细胞损伤［24-25］。
        因此，本研究采用PAN构造足细胞经典损伤模型，应用FK506作用于足细胞模型后，观察肾小球足细胞分子podocin的mRNA和蛋白的表达与分布，并探讨FK506修复足细胞损伤模型中的可能机制。本研究发现，PAN组在PAN药物处理之后，足细胞数量明显降低，足突结构回缩且数量明显降低，细胞排列散乱；而FK506组足细胞胞体及足突形态结构趋于正常，较PAN组细胞连接紧密，这表明FK506能够稳定足细胞形态结构正常，改善PAN引起的足细胞足突裂孔膜等结构损伤。本研究发现PAN抑制肾小球足细胞podocin的mRNA及蛋白表达量，而FK506能够改善PAN引起的肾小球足细胞结构功能的损伤，恢复足细胞正常的形态结构，表明足细胞标志蛋白podocin在mRNA及蛋白水平在时间上表达同步，呈正相关，FK506能够提高podocin蛋白的表达，提高细胞结构的完整性及稳定性。同时免疫荧光结果显示，在PAN组中podocin 蛋白分布散乱且不均一，而在对照组及FK506组中，其蛋白主要分布于细胞核膜及胞膜表面，且胞质中分布均匀，PAN作用于足细胞是足细胞损伤的经典模型，导致足细胞podocin蛋白表达分布异常，这表明FK506能够有效地改善肾小球足细胞标志蛋白podocin的表达与分布，修复损伤的足细胞，并使足细胞能够发挥正常的结构功能。
        因此，推论PAN能够通过多种信号通路破坏肾小球足细胞结构及形态功能，抑制podocin等多种蛋白的表达，破坏正常的滤过功能并导致蛋白尿的发生；而FK506则通过维持裂孔蛋白podocin的表达，抑制PAN对足细胞产生的损伤作用，进而抑制蛋白尿的产生。另外，最新文献报道，肾损伤跟足细胞自噬有一定的关系，其中包括磷酯酰肌醇3激酶-丝/苏氨酸蛋白激酶（PI3K-Akt）信号通路及pink1/parkin等多条信号通路的自噬过程参与足细胞的损伤与修复，而线粒体自噬是足细胞损伤修复的重要机制［26-28］。FK506能够通过抑制足细胞自噬发挥保护足细胞的功能［29］，推断podocin蛋白的表达与分布也可作为研究足细胞自噬对肾脏损伤及程度的标志蛋白，同时，FK506可稳定肾小球足细胞podocin蛋白的表达及分布，维持足细胞结构及功能，为研究足细胞自噬及肾脏病蛋白尿防治提供新的方向。

参考文献略


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