流式细胞仪检测结直肠癌患者细胞外囊泡的蛋白质谱和大小

2023-05-10 14:56:27

细胞外囊泡(EV)引起了相当大的科学和临床兴趣,但由于它们的小颗粒尺寸,低蛋白质丰度和总体异质性,蛋白质分析和单个EV的尺寸仍然具有挑战性。厦门大学颜晓梅教授团队基于实验室制造的高灵敏度流式细胞仪(HSFCM),报告了一种快速方法,可对单个EV低至40 nm的分析速度进行定量多参数分析,分析速度高达每分钟10,000个粒子。在几分钟内获得统计学上粒度分布,其分辨率和分布与冷冻透视电镜测量的分辨率和分布良好匹配。通过免疫荧光染色定量表达CD9,CD63和/或CD81的EV的亚群。当使用HSFCM分析血液样品时,与健康对照相比,结肠直肠癌患者中CD147阳性EVs水平显着升高(P <0.001)。 HSFCM为表面蛋白质分析和单个EV的尺寸提供了一个敏感和快速的平台,这可以极大地帮助理解EV介导的细胞间通讯和先进的诊断和治疗策略的发展。

图示在单颗粒级别的EV的HSFCM分析。 (a)来自细胞的EV的两种分泌途径。 (b)通过来自人细胞培养物和人血样品的条件培养基的差速超离心进行EV分离的示意图。 (c)从人结直肠癌HCT15细胞培养物的上清液中分离出的EV的代表性冷冻透视电镜照片。 (d)实验室制造的HSFCM示意图,用于同时检测单个EV的侧向散射(SSC)和双色荧光。 (e)PBS(i)和EV(ii)具有100μs的箱宽度的代表性SSC突发迹线。 ▼表示饱和APD检测器的峰值。 (f)PBS(红色)和EV(黑色)的SSC分布直方图,其来源于每次2分钟收集的数据。 (g)在(i)之前和之后(ii)1%Triton X-100处理1小时之前从HCT15细胞分离的具有代表性的SSC爆发痕迹。 (h)从不同细胞系培养物的上清液和健康供体的PFP分离的EV的纯度评估。

图示用于EV粒径分布分析的HSFCM,cryo-TEM和NTA的比较。 (a)通过cryo-TEM(n = 1,034)从结肠直肠癌HCT15细胞中分离的EV的粒径对于EV宽度为10nm的粒度的直方图。 (b)五种不同直径范围在47和123nm之间的单分散SiNP混合物的SSC分布直方图,并拟合成高斯峰的总和。 (c)高斯拟合的SSC强度(在折射率校正之后)作为EV粒度的函数的图。 (d)HSFCM(n = 10,720)EV样品的粒子直径为1nm的粒度直方图。 (e)针对由NTA单独测量的五种尺寸的SiNP的单个样品的编制的粒度分布直方图。 (f)由NTA测量的EV样本的粒度分布直方图。

图示在免疫荧光染色后从HCT15细胞分离的EV上的特定蛋白质的HSFCM分析。 (a)用对CD9(i),CD63(ii)或CD81(iii)特异性的缀合有PE的MAb荧光标记的EV分离物的PE橙色荧光与SSC的双变量点图。 (b)CD9(i),CD63(ii)和CD81(iii)在单个EV上的蛋白拷贝数的分布图。 长度代表四分位间距(第一到第三四分位数)。 (c)通过针对CD9 / CD81(i),CD63 / CD81(ii)或CD9 / CD63(i)的抗体进行双免疫荧光染色时,EV分离物的PerCP-Cy5.5红色荧光与PE橙色荧光的双变量点图(iii)

图示分析两种结直肠癌细胞系和正常结肠成纤维细胞系的细胞培养上清液中的CD147阳性EVs。 a-c,CD147橙色荧光的双变量点图 - 对于用PE-MAb免疫荧光标记抗CD147从CCD-18Co(a),HCT15(b)和HCT116(c)细胞分离的EV的SSC。 (d)通过HSFCM和免疫印迹数据(每泳道加载10μg蛋白质)比较CD147阳性EVs(每个样品n = 3)的比例。

图示HSFCM分析结直肠癌患者和健康献血者的血浆样品中CD147阳性EV。 (a)对于80纳米直径的荧光硅纳米颗粒与从健康供体的PFP分离的EV的混合物,BRITC橙色荧光与SSC的双变量点图。 (b)健康供体(n = 32)和结直肠癌患者(n = 37)中EVs的血浆颗粒浓度(平均值±标准差)。通过ANOVA检验计算P-值。 (c)PE偶联的MAb抗CD147免疫荧光染色后,从患者样品中分离的EV的PE橙色荧光与SSC的双变量点图。 (d)健康供体(n = 32)和结直肠癌患者(n = 37)中CD147阳性EV的血浆颗粒浓度(平均值±标准差)。通过ANOVA检验计算P-值。 (e)在不同癌症阶段的健康供体和结直肠癌患者中CD147阳性EV的血浆浓度。盒子长度表示四分位间距(第一到第三四分位数)。方块中心的线表示中间值。通过ANOVA检验计算P-值。 (f)手术切除肿瘤前(手术前)和手术后(手术后7-10天)结直肠癌患者(n = 16)中CD147阳性EV的血浆浓度变化(平均值±s.d.)。 P值由配对双尾Student's t-检验计算。

图示通过CD147阳性EVs浓度(AUC:0.932; 95%CI:0.873-0.992)或EV总浓度(AUC:0.631; 95%CI:0.498-0.764)评估的健康供体和结直肠癌患者之间的ROC曲线 PFP样品。 AUC,曲线下面积; Cl,置信区间。


【总结】蛋白质分析和单个EV的大小是了解其功能的基础。通过HSFCM的发展,颜晓梅教授团队将单细胞分析的流式细胞术的统计功率,高通量和多参数能力扩展到小至40nm的单个EV。特别是,证明了基于单个囊泡的光散射测量,可以在几分钟内获得准确和统计上代表性的EV的粒径分布,其分辨率与cryo-TEM相当。尽管已报道细胞衍生囊泡的大小范围为30-1,000nm,但从HCT15细胞系中分离的绝大多数(97%)EV确定小于150nm。更重要的是,荧光染色和检测蛋白质的能力有助于识别不同的EV亚型,包括与疾病有关的EV。由于免疫印迹只需要2%的样本量,HSFCM能够实现单个EV的蛋白质分析以及定量列举不同的EV子集。另外,研究还证实了血浆CD147阳性EV浓度对结直肠癌诊断和治疗监测的高预测价值。尽管这里仅使用一种蛋白质标志物(CD147)用于结直肠癌诊断,但HSFCM的多色分析能力在单个EV的多参数分析中提供了明显的优势。因此,可以区分多个EV群体,以提高诊断的特异性,灵敏度和准确性。此外,HSFCM可以很容易地应用于其他体液(如尿,腹水,唾液,和母乳)以及用作治疗剂的EV的质量控制分析。


原文引自:Tian Y, Ma L, Gong M, et al. Protein Profiling and Sizing of Extracellular Vesicles from Colorectal Cancer Patients via Flow Cytometry[J]. ACS Nano, 2018,12(1):671-680.

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