质粒DNA纯化柱饱和吸附能力测试方法

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 核酸纯化柱的作用

在高盐和低pH值的条件下，核酸纯化柱中的硅胶膜对核酸有专一性的吸附力，对其他组分如蛋白质、多糖、脂类则基本不吸附，因而能很好地分离纯化核酸。质粒纯化柱作为核酸纯化柱的一种，用于分离提取质粒DNA。

质粒纯化柱的优劣直接决定质粒DNA试剂盒的性能--那怎么评估质粒纯化柱的性能呢？这里就涉及一个质粒纯化柱饱和吸附能力的问题，今天我们就设计一个实验来测试不同质粒纯化柱的吸附极限。

   

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 实验前准备

在实验前一天先挑选一种含高拷贝的质粒的细菌进行过夜培养。实验前先取培养好的3 ml菌液进行质粒DNA提取（步骤参考Simgen 快速质粒DNA小量试剂盒操作说明书），用60 μl Buffer E 洗脱，测量DNA浓度结果如下：

平均3ml获得质粒DNA的总量是338×60=20,280 ng，即20.28 μg。因此估算得到每毫升菌液大约含有质粒6.7μg。

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 对比实验的方法

接下来是具体的实验方法：本次实验选取了实验室中4种不同的纯化柱各2个，分别编号为A（simgen质粒小提中量试剂盒配套使用，标记为1、2）、B(Simgen 快速质粒DNA小量试剂盒配套使用标记为3、4)、C（标记为5、6）和D（标记为7、8）。

为了确保纯化柱能够达到饱和吸附，必须使得有充分过量的质粒DNA加入到纯化柱中，所以本次实验中每个纯化柱中加入了15 ml菌液中所含质粒DNA的量，考虑到增大菌量后菌体中质粒DNA的释放效率会有所下降，粗略估计加入纯化柱质粒DNA大约在80~100 μg之间。

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实验步骤与结果

操作步骤（更详细的步骤参见simgen质粒小提中量试剂盒）如下:

1、取14个2 ml离心管各收集10 ml菌液；

2、加入500 μl Buffer Ⅰ，充分悬浮；

3、加入500 μl BufferⅡ，温和翻转离心管使细菌裂解释放质粒；

4、加入700 μl Buffer Ⅲ，充分温和翻转离心管使其完全中和（沉淀物颜色变为淡黄色），12000 rpm离心10 min

5、将所有上清液混合在一起，用移液枪量取800 μl加入各个纯化柱，离心去滤液，重复3次，确保加入过量的质粒DNA用于吸附（此处是重点！！！）

6、依次用500 μl Buffer W1和700 μl Buffer W2进行洗涤

7、纯化柱上的质粒DNA用100 μl Buffer E 洗脱

获得的质粒DNA测量结果如下：

结果显示，饱和吸附量最高的是质粒纯化柱A，平均能够吸附约49 μg以上的质粒DNA，饱和吸附量最低的是质粒纯化柱B，但平均也能吸附约34 μg以上的质粒DNA。

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实验结果的分析

对于质粒纯化柱性能的评估，很多厂家没有进行质粒DNA饱和吸附能力的测试，因此就很难客观评价纯化柱的优劣。实际上纯化柱A、B、C、D中加入的质粒DNA在未达到饱和的前提下（比如通常的从1-5 ml 菌液中提取质粒DNA）纯化DNA，获得的质粒DNA浓度差异不大，但是如果加入过量的质粒DNA，差异就体现出来了。

根据我们以往的测试结果来看，国产硅胶膜材质制作的质粒纯化柱的饱和吸附能力普遍低于进口的硅胶膜材质（本次实验测试的质粒DNA纯化柱均用进口硅胶膜组装），所以对纯化柱进行饱和吸附能力测试也是一个有参考意义的鉴别的方法。

另外经常做质粒DNA提取的同学也可以回想一下平时提取质粒时的情况，如果使用的是Simgen质粒DNA试剂盒，可能纯化柱还有好多吸附空间都白白浪费了。现在有了这个最大吸附饱和度的数据，在实验中也可以计划下如何最大限度地利用纯化柱的吸附能力；针对一些低拷贝的质粒如果采用多次过柱的方法得到较高的浓度，也是一种不错的运用哦。

如果您也有遇到核酸纯度相关问题或其他核酸纯化问题，欢迎在公众号留言或发邮件给小新 technical@simgen.cn

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