论文|EV71病毒3C蛋白真核表达载体的构建及表达

2023-05-10 14:56:27

2018年08期

作者：张华^1,2，李兴志^1,2，张雅婷^1,2，邹德华^1,2，郑亮^1,2，程丽鑫^1,2，沈玉^1,2，曹宏伟^1,2*

单位：1.黑龙江八一农垦大学生命科学技术学院；2.黑龙江八一农垦大学生物技术中心

简介：张华，副教授，博士，从事分子病毒学与免疫学研究。*通讯作者，教授，博士，从事分子病毒免疫与基因工程制药研究。

基金项目：黑龙江省教育厅科学技术研究面上项目（12541578）。

口蹄疫病毒（FMDV）是属于小RNA病毒科的单股正链RNA病毒，FMDV病毒感染会引起偶蹄动物共患的急性、热性、接触性传染病。研究发现，FMDV病毒的致病性与其自身编码的3C蛋白密切相关，其具有帮助病毒自身复制、切割宿主蛋白、诱导细胞凋亡、逃避宿主免疫监视的重要生物学功能。

在前期研究中，发现同属小RNA病毒科的肠道病毒71型（EV71）同样具有切割宿主因子，拮抗宿主天然免疫等现象。已有研究提示人们EV71病毒3C蛋白具有发挥类似FMDV病毒3C蛋白功能的可能性，但是诸多小RNA病毒科病毒在感染过程中，3C蛋白是否发挥相同的生物学功能尚不清楚。

目的

为了进一步研究小RNA病毒科3C蛋白的功能是否具有普遍相似性，并尝试解析3C蛋白的结构与功能基础，笔者构建了EV71病毒3C蛋白真核表达载体，并进行了表达验证，以期为深入研究FMDV病毒3C蛋白和EV71病毒3C蛋白功能的异同奠定一定的基础。

方法

采用RT-PCR技术，从EV71病毒基因组RNA中扩增3C基因，克隆到真核表达载体pcDNA3.0-Flag上（图1），并转染HeLa细胞，通过Western blot和免疫荧光验证3C蛋白的表达。

图1 pcDNA3.0-Flag-3C表达载体的构建流程

结果

◆EV71病毒3C的PCR扩增

逆转录病毒基因组RNA成为cDNA，并以总cDNA为模板，PCR扩增EV71病毒3C基因片段，所扩增的PCR产物约为549bp，与预计大小相同，为所需要的EV71病毒3C片段（图2）。

图2 EV71病毒3C的PCR扩增

◆重组质粒的PCR鉴定

从LB平板上挑取克隆扩大培养后少量提取质粒，以提取的重组质粒为模板，进行PCR鉴定。所扩增的PCR产物约为549bp，与预计大小相同，为EV71病毒3C片段（图3）。

图3 重组质粒PCR鉴定

◆重组质粒的双酶切鉴定

将进行准确测序后的pcDNA3.0-Flag-3C重组质粒进行双酶切检测，电泳结果如图4。在549bp处出现目的条带，与预期结果相符。

图4 重组质粒的双酶切鉴定

利用鼠抗Flag单克隆抗体检测pcDNA3.0-Flag-3C重组载体的表达，结果显示在HeLa细胞中表达的重组载体能特异性结合Flag单克隆抗体，蛋白大小与预期相符（图5）。

图5 Western blot鉴定EV71病毒3C融合蛋白的表达

◆荧光显微镜观察EV71病毒3C蛋白的定位

倒置荧光显微镜观察红色荧光在HeLa细胞中的分布，以确定EV71病毒3C蛋白在细胞中的定位，结果显示EV71病毒3C蛋白在HeLa细胞核与细胞质中均匀分布。

图6 EV71病毒3C在HeLa细胞中的定位

结论

该研究成功构建了真核表达载体pcDNA3.0-Flag-3C，为进一步研究EV71病毒3C蛋白生物学功能奠定了一定基础。

安徽农业科学

学术｜科普｜三农｜聚焦｜学习｜生活

一个接地气的学术期刊公众号

论文投稿：ahnykx@aaas.org.cn

✎采编：小白 ✎排版：小同

大家在看