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间充质干细胞分泌组:创伤愈合的替代疗法

干细胞快讯 2021-02-05 07:21:41

编辑、整理  希希

  王强、刁勇、林继志




在世界范围内,大约2%的人正在忍受慢性皮肤伤 口的病痛,每年有30万人因皮肤损伤而致死。伤口愈合是一个非常复杂、由多种因素共同参与的过程,包括 炎症、增生和组织再塑等阶段。尽管有许多新技术(包括生长因子和皮肤替代物)被广泛用于促进伤口愈合,但在大多数情况下,现有治疗方法能实现伤口愈合的百分比仅为50%~60%。

 

大量的临床前和临床试验表明,间充质干细胞治疗可以加速伤口愈合,为各种难以愈合的慢性伤口的治疗带来了希望。MSC是人体内来源较丰富的成体干细胞,从骨髓、脂肪组织、表皮、血液等组织中均可以分离得到,可参与伤口修复过程的不同阶段,通过分化为表皮细胞、内皮细胞和周细胞,减轻炎症反应,并促进血管生成等作用加速伤口修复。


图片源自网络


MSC对慢性伤口的治疗作用可以归因为3个关键机制:

⑴归巢作用,即移植的MSC通过趋化因子梯度迁移至发生损伤的特定区域


⑵细胞分化,即MSC通过分化成多种类型的细胞替换受损组织,使得功能恢复


⑶分泌作用所分泌的生物活性因子具有影响局部和全身生理过程的潜能。正是MSC可以通过多种机制发挥作用,才使得其疗效明显优于单一生长或细胞因子治疗

 

最新的研究表明,输送至创伤部位的MSC寿命相对短暂,也极少会分化形成新的细胞或组织。此外,在动物模型中还发现,尽管植入的MAC远离实际损伤部位,但仍可以促进伤口愈合。提示MSC的旁/自分泌作用,可能通过抗炎、抗凋亡、免疫调节、新生血管形成等机制发挥治疗作用。近年来,对MSC所分泌的生物活性因子的构成及功能进行研究的分泌组学,引起人们极大兴趣。推测基于MSC分泌组研制的生物制剂,可能会对许多生理过程的调节和治疗具有应用前景。

 


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MSC分泌组



应用MSC治疗创伤的最初研究,一直基于提供至伤口部位的MSC能够分化为伤口愈合所需的细胞类型这一假说。然而,研究结果表明,MSC并不能在伤口部位保持较长时间。另外,还有研究发现在伤口处并不能检出长期植入的MSC,也不能检出由植入MSC分化形成的功能细胞。之后又有人提出植入MSC可能通过与伤口局部的细胞融合而发挥作用。但无论假设MSC是通过分化、还是通过融合机制发挥作用,都因为新形成的功能细胞数量过少,难以支持其功能的明显提高而受到质疑。因此,Gnecchi等提出MSC主要以旁分泌的形式,通过所分泌可溶性因子发挥作用这一假设,逐渐得到了实验认可。Shabbir等将MSC注射至仓鼠腿肌腱内,经PCR检测,在其它组织中未发现移植细胞的转移,但心肌梗塞仓鼠的心室功能得到明显改善,并发现多种生长因子的表达增强,细胞凋亡和心肌纤维化减轻,出现心肌再生迹象。另外,肌肉注射培养MSC的条件培养基后,治疗效果依然非常明显。

 

近年来,随着蛋白质分离和蛋白质组学技术的发展,有关MSC释放的活性因子及其对生理过程影响的研究日益增多,发现MSC分泌组的成分种类繁多,包括细胞因子、趋化因子、生长因子、细胞外基质蛋白/酶以及miRNA。对MSC分泌组的功能研究发现,这些活性成分可以促进细胞增殖、分化和生存,促进血管生成和减少炎症反应等,所有这些功能均有利于组织再生和伤口愈合,为其临床应用提供了理论基础。

 

从临床应用的角度,MSC分泌组与MSC相比,可能拥有明显优势。因为分泌组可以绕过与细胞治疗有关的免疫相容性、疾病传染性等相关问题,也可以降低细胞培养和维护所需的时间和成本。由于分泌组可以批量生产,且可长期保存,对于心肌梗塞、脑缺血、或创伤等急性疾病的治疗更具优势

 


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MSC条件培养基可促进创伤愈合



MSC通过旁分泌或自分泌作用,产生分泌组活性成分。研究人员很自然地考虑到能否用培养过MSC的培养基,即条件培养基,间接研究MSC分泌组对创伤的作用。因为在MSC的体外培养过程中,其分泌组活性成分一定会存在于所使用的培养基中。所使用的MSC种类包括骨髓MSC、脂肪MSC、牙髓MSC等。Chen等发现骨髓MSC条件培养基可以募集巨噬细胞及血管内皮细胞迁移至创伤部位,并促进愈合。在骨髓MSC条件培养基中,各种生长因子,如血管内皮生长因子(VEGF)、胰岛素样生长因子(IGF)、表皮生长因子(EGF)、角质细胞生长因子(KGF)、血管生长因子1(Ang1)、基质细胞衍生因子(SDF1)、促红细胞生成素(EPO)表达水平明显提高。脂肪干细胞条件培养基可刺激胶原合成和皮肤成纤维细胞的迁移,从而促进伤口愈合。脂肪干细胞条件培养基上调成纤维细胞中I型前胶原蛋白α链基因的转录,激活Rho相关激酶信号通路,促进角质形成细胞和真皮成纤维细胞的增殖。 牙髓MSC条件培养基可提高真皮成纤维细胞增殖和迁移活性,促进胶原蛋白的合成,在缺血性脑损伤大鼠体内还可以促进血管生成,以及内源性神经祖细胞的迁移和分化。

 


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MSC分泌组促进伤口愈合的作用机制



免疫调节作用

在创伤的初始阶段,先天的免疫反应引起炎症反应,避免伤口感染。之后炎症反应的严重程度,不仅决定创伤愈合的速度,还决定伤口是否会转为慢性难愈合类型。过强且持续的炎症反应,往往会引起伤口延期愈合或不愈合,并增加伤口的纤维化程度。MSC具有免疫调节和诱导免疫耐受的作用,可以改善和调节破坏性炎症反应。已知MSC通过细胞与细胞间直接相互作用,分泌可溶性因子,和抑制免疫细胞发挥免疫调节作用。MSC分泌组可抑制T、B细胞的增殖,抑制中性粒细胞产生H2O2,抑制T和NK细胞的细胞毒作用,以及抑制单核细胞的分化和成熟。一些促炎性细胞因子,如干扰素γ(IFNγ)、肿瘤坏死因子α(TNFα)、白细胞介素1α和1β(IL1α和1β),还可以促进MSC分泌组的免疫调节功能。

 

促进血管生成

血管生成的速度与质量,是伤口愈合的关键因素。损伤的组织必须从血液供应中获取足够的养分及氧气,才能保证相关细胞的迁移、增殖和分化。体外和体内研究表明,MSC分泌组对血管生成起着重要的调控作用。血管生成为从预先存在的血管中产生新血管的过程。正常的血管生成不仅对发育过程非常重要,而且对伤口愈合过程也至关重要。各种各样的活性分子,如生长因子、趋化因子、酶、基质金属蛋白酶、黏附分子,参与血管生成过程的紧密调节。体外研究表明,来源于不同种类的MSC,包括脂肪MSC、脐静脉MSC、羊膜MSC以及骨髓MSC的分泌组,均对血管生成多个关键步骤有影响,可以诱导血管内皮细胞增殖、迁移和管形成,以及抑制内皮细胞凋亡。

通过ELISA、免疫组化、及蛋白质谱等技术手段,已鉴定出多种存在于MSC分泌组的血管生成促进因子和血管生成抑制因子。这些因子包括VEGF、碱性成纤维细胞生长因子2(FGF2)、白细胞介素6(IL6)、胎盘生长因子、Ang1、单核细胞趋化蛋白1和富含半胱氨酸的血管生成诱导因子61(Cry61)。培养条件的变化,还可以改变这些血管生成因子的分泌。以转化生长因子α(TNFα)处理MSC,可以增加MSC分泌组中多种生长因子[VEGF,肝细胞生长因子(HGF)、血小板衍生生长因子(PDGF)、IL6和IL8]的浓度,并刺激体内血管生长速度更快。

 

抗细胞凋亡作用

在伤口愈合的不同阶段,所发生的众多生化和细 胞过程均高度依赖于充足的氧气供应,其中包括能量代谢、活性氧生成、感染控制、信号传导、细胞外基质重塑等。而在慢性伤口中往往供氧不足,而引起细胞的凋亡。MSC可以促进细胞凋亡抑制蛋白Bcl2的表达,而降低凋亡促进蛋白Bax和裂解的caspase3的表达而发挥细胞保护作用。经过基因改造的可过表达Akt的MSC(AktMSC),在体内移植后不到72小时就可以恢复急性心肌梗塞大鼠心脏的功能,其疗效一定是AktMSC的旁分泌作用,而不是心肌再生。在缺氧条件得到AktMSC的条件培养基,可明显抑制低氧诱导的大鼠心肌细胞凋亡。急性心肌梗塞大鼠注射经低氧诱导的AktMSC条件培养基,可显著减少心肌梗死面积,改善心室功能。经检测,经低氧诱导的AktMSC条件培养基中,有利于心肌梗死治疗的细胞因子,如VEGF、FGF2、HGF、IGF1和胸腺素β4等的表达显著上调。

 


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MSC分泌组组分的优化



考虑到急性和慢性损伤各阶段各种复杂因素的相互作用,如何优化分泌组组分,使其充分满足伤口愈合不同阶段的需要,是获得最佳疗效的前提。更深入地研究在损伤和伤口愈合阶段各种细胞因子的表达时空模式,应有助于基于分泌组的新治疗方案的确定。还需要进一步研究分泌组的组成,确定具有治疗作用的因子。因为,并非所有的分泌组成分都对创伤愈合有 益,如肿瘤坏死因子α(TNFα)、IL6可能不利于创伤愈合。

通过改变MSC的培养条件,可以改变MSC的分泌组组成。可采取的手段包括将MSC暴露于缺氧环境、细胞因子诱导、与其他细胞共培养以及基因编辑等。

 

缺氧诱导

多项研究表明,将MSC暴露于缺氧条件培养,以模仿损伤后的体内缺血性环境,可上调促生存和血管生成因子表达,其中包括VEGF、IGF1、HGF和Ang1。低氧预处理MSC,可提高分泌组中HGF和VEGF的含 量,有助于减轻损伤和改善功能修复,提高治疗效果。缺氧预处理还可以增加心脏干细胞表达趋化因子CXCR4,显著提高心脏干细胞迁移和募集至心肌梗死缺血区的能力。

 

细胞因子诱导

将MSC暴露于不同的细胞因子,也可以改变其分泌组成分。Lee等以TNFα诱导脂肪MSC,发现在分泌组可检出的187种组分中,有118种表达明显提高。IL6是一种促炎性细胞因子,可以通过转录因子3信号诱导及激活蛋白(STAT3)激活细胞促生存信号通路。以IL6处理神经干细胞后,STAT3信号通路的激活促进了线粒体中主要抗氧化酶,锰超氧化物歧化酶的表达,同时诱导VEGF的表达上调,对氧化应激和缺血再灌注损伤提供了有效保护。

 

培养模式诱导 

细胞间相互作用对MSC分泌组也有很大影响。以单层细胞形式培养的MSC,由于生长条件难以反映体内微环境,往往会失去干细胞的特性。而在三维球体中聚集生长的MSC,其多向分化能力显著提高。相比传统的二维培养,三维培养的MSC在基因表达上存在明显的差异,CXCR4、多个抗癌蛋白(TRAIL,IL24和CD82)、抗凋亡蛋白斯钙素1和抗炎蛋白TSG6均表达上调。


基因编辑

对MSC通过基因编辑技术进行遗传改造,也可以增加特定组织营养因子的产生。遗传改造后,不仅可以上调MSC细胞因子和生长因子的表达,还可以升高某些关键酶的水平。半乳糖凝集素1是一种糖结合蛋白,可在细胞生长、分化、凋亡等多个方面发挥作用。通过慢病毒载体,将半乳糖凝集素1转入神经干细胞。脊髓损伤动物在移植高表达半乳糖凝集素1的神经干细胞后,髓化神经面积、皮质脊髓纤维、5羟色胺能纤维等多项指标都明显优于仅接受普通神经干细胞移植的动物。说明基因治疗与细胞治疗技术的结合,今后在临床将更具发展前景。

 

 

研究已经证明MSC分泌组与许多重要的细胞过程有关连,包括血管生成、免疫和炎症调节,有望成为伤口愈合和组织修复的新型疗法。各种干细胞分泌组的功能,已经以条件培养基的形式在动物模型得到验证,所涉及的病理过程包括心脏、神经系统、泌尿系统、肾损伤等。MSC分泌组代表了一种很有应用前景的干细胞治疗的替代疗法,一旦应用于临床,在精准用药方面,包括剂量和给药方式等,具有更大的灵活性。


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