流感病毒M1与NA蛋白的相互作用以及其在病毒出芽中的作用

2023-05-10 14:56:27


   

文章来源

包旦奇,候天龙,李泽君,刘芹防,张七斤.流感病毒M1与NA蛋白的相互作用及其在病毒出芽中的作用. 中国动物传染病学报,2017,25(5):1-4.


摘  要:流感病毒是一种囊膜病毒,各组分在细胞质膜组装并以出芽形式释放病毒。其中基质蛋白1,即M1蛋白对病毒的致病性和病毒粒子形态的稳定起重要作用。NA蛋白是流感病毒的表面蛋白之一,可启动病毒的出芽。M1蛋白和NA蛋白间是否存在相互作用,以及相互作用对病毒出芽的影响还存在未知。本研究利用双分子荧光互补试验证明M1蛋白与NA蛋白存在相互作用。利用体外出芽试验发现单独表达的M1蛋白不能出芽,而单独表达的NA蛋白可以完成出芽;共表达NA与M1蛋白时,M1蛋白可以出芽,表明NA蛋白可以与M1蛋白发生互作并协助M1出芽。

      流感病毒是一种负链RNA病毒,属正黏病毒科,基因组分为8个片段,编码至少10种蛋白,其中包括HA、NA、M2在内的表面蛋白,3个RNA聚合酶蛋白PB2、PB1、PA,核蛋白NP,基质蛋白M1以及非结构蛋白NS1和NS2。同时流感病毒也是一种囊膜病毒,其所有结构蛋白在细胞内合成后在病毒的出芽位点质膜依次组装,并最终依靠出芽的方式从感染的细胞扩散。这期间病毒的表面蛋白率先定位于细胞膜脂筏上的出芽位点启动病毒出芽,其胞内域与病毒内部蛋白连接并组装为完整的病毒颗粒(virus-like particles,VLPs),并在表面蛋白的带动下出芽,释放到细胞外。

       NA与M基因的搭配会影响流感病毒的致病性。2009年H1N1大流行毒株的NA与M基因来源于欧亚类禽毒株,研究证明,NA基因与M基因的搭配对其致病性有重要的作用,但具体的机理尚不清楚。M基因可以表达M1与M2蛋白。研究显示NA蛋白可能通过胞内区域与病毒的内部蛋白相互作用,但是具体的机制不清楚,本研究利用双分子荧光互补(Bimolecular fluorescence complementation,BiFC)技术与出芽试验对M1与NA蛋白的相互作用以及其在出芽中的作用进行了相关研究。

1
双分子荧光互补试验


质粒构建

使用RNA提取试剂盒提取流感病毒基因组RNA,用反转录试剂盒将其反转录为cDNA备用,利用已设计好的特异性引物PCR扩增M1与NA基因片段。将扩增好的M1片段克隆入BiFC系统工作质粒VC(酶切位点为Xho I与Not I),构建VC-M1质粒;已扩增的NA片段克隆于BiFC工作质粒VN(酶切位点为Xho I与Not I),命名为VN-NA。


细胞培养与质粒转染

采用腔室载玻片培养293T细胞,20 h后用PBS清洗细胞,将已构建的BiFC系统质粒VC-M1与VN-NA质粒(0.1 μg/质粒)均匀混合于50 µL Fresh-opti-MEM,每孔每质粒200 ng,并使用mirus转染试剂共转染于293T细胞。


细胞固定、染色与观察

转染20 h后,吸去细胞上清,PBS清洗细胞,4%多聚甲醛固定细胞10 min;吸去多聚甲醛固定液,用0.1%Triton X-100透化处理细胞10 min;弃透化液,用DAPI染料对细胞染色5 min;吸去DAPI染料后PBS清洗细胞,最后在载玻片上滴加封片液,盖上盖玻片完成封片。倒置荧光显微镜下观察荧光,在细胞中发现了较强的绿色荧光,说明NA蛋白和M1蛋白之间存在较强的相互作用。

1  利用BiFC检测M1蛋白与M2蛋白相互作用

Fig.1  Interaction between M1 and NA protein in 293T cell by using BiFC system


2
出芽试验


质粒构建

将已扩增的M1片段利用酶切位点Xho I与Not I克隆到3Flag标签的真核表达质粒(3Flag-M1),而NA片段克隆于带2ha标签的真核表达质粒,称为ha-NA。

单独表达的M1蛋白不能完成出芽

为了进一步研究M1的体外出芽能力,将3Flag-M1转染293T细胞,48 h后收集细胞上清,进行VLPs纯化,将纯化好的VLPs与细胞裂解物进行Western blot分析。结果显示,M1蛋白在293T细胞可以成功被表达,但是在纯化的VLPs中检测不到M1蛋白,结果说明单独表达的M1蛋白没有出芽能力,不能完成体外出芽。

图2  VLPs和293T细胞中M1蛋白的Western blot检测

Fig.2  Western blot for M1 protein in VLPs and  transfected 293T cell


单独表达的NA蛋白可以完成体外出芽

为了进一步研究NA蛋白的体外出芽能力,将ha-NA质粒转染293T细胞,48 h后收集细胞上清,进行VLPs纯化,将纯化好的VLPs与细胞裂解物进行western-blot分析。结果显示,NA蛋白在293T细胞可以成功被表达,而且纯化的VLPs中可以检测到高水平的NA蛋白,结果说明单独表达的NA蛋白具有出芽能力,可以完成体外出芽。


图3  VLPs和293T细胞中NA蛋白的Western blot检测

Fig.3  Expression analysis of NA protein in VLPs and transfected 293T cell by Western blot

NA蛋白可以帮助M1蛋白出芽

BiFC试验证实NA蛋白与M1蛋白存在相互作用,但是这种相互作用在病毒出芽中的作用不清楚。为了研究此相互作用对NA与M1蛋白出芽的影响,我们将3flag-M1、2ha-NA质粒共转染293T细胞,转染后48 h,收集细胞上清进行VLPs分离,对VLPs与细胞分别进行Western blot检测。结果显示M1蛋白和NA蛋白在细胞内成功被表达,而且在纯化过的VLPs中,可以同时检测到M1与NA蛋白。由于体外单独表达的M1蛋白不能完成出芽,但是与NA蛋白共表达时M1可以出芽,说明具有出芽能力的NA蛋白通过相互作用协助M1蛋白出芽。

图4  M1蛋白与NA蛋白体外出芽情况

Fig.4  Budding of M1 protein and NA protein in  co-transfected 293T cells


本研究利用体外出芽试验证明M1并不具备单独出芽的能力,在病毒出芽过程中,M1蛋白必需与病毒表面蛋白的胞内区域结合,并被携带出芽。不同于M1,作为表面蛋白的NA可以单独出芽。双分子荧光互补试验和病毒体外出芽试验结果显示M1蛋白和NA蛋白之间存在较强的相互作用,也正是这种相互作用帮助M1蛋白出芽。本研究揭示了M1蛋白与NA蛋白之间相互作用在流感病毒复制中的作用, 下一步可鉴定M1与NA相互作用的功能区域,以期为新型抗流感病毒药物研发和相关研究提供理论依据。

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