原创|抗体Fab片段纯化平台

本文描述的是大肠杆菌发酵生产的Fab抗体片段的三步纯化工艺开发方法。首先选择较宽泛的预洗和洗脱条件，通过96孔板（PreDictorTM）进行填料筛选。接下来用纯化好的目的蛋白选择小柱进行填料载量研究，并通过该步优化最优洗脱pH。最后具体每一步的条件将通过实验设计（DoE）进行优化。96孔板筛选属性空间，DoE筛选设计空间和操作空间，这种方法符合质量源于设计理念（QbD）。在三步纯化过程中采用CaptoTM L、Capto SP ImpRes和Capto Q填料将会非常有效的去除主要杂质，并且总工艺的收率不低于87%。此开发平台能增加治疗性抗体片段的开发效率和生产力（文末有惊喜，记得看完）。

在单克隆抗体之后，抗体片段（Fab、scFv及抗体结构域等）将会成为下一代重要的蛋白治疗药。抗体片段在分子结构和分子量上具有优势，能使其轻松的穿梭于组织之间，因此抗体片段能应用于广泛的诊断和治疗中。

在单抗纯化工艺中，Protein A亲和层析捕获是工业的金标准。该工艺中高纯化因子和普通的纯化条件已经被许多生物药企认可。但抗体片段之前却缺乏相关的纯化平台解决方案。随着Capto L的引入，首个抗体片段工业化纯化平台正在形成。Capto L是一款以重组Protein L为配基的生物过程层析填料，它将广泛的应用于含有卡帕轻链不同大小的抗体片段（如图1）的亲和层析过程。

图1 Capto L上的protein L配基能与抗体κ轻链相结合，LambdaFabSelect能与Fab片段的λ轻链结合，KappaSelect能与Fab片段的κ轻链结合，MabSelect填料能用于包含VH3结构域的抗体片段。

我们将描述一个用Capto基质填料纯化源于大肠杆菌上清液的含有κ轻链的Fab抗体片段的纯化工艺。表1是Fab的属性。

在这三步工艺中，工作流程是通过高通量工艺开发为工具以项目开发时间最小化为目标进行的：

1.通过96孔板筛选填料、预洗和洗脱条件；

2.用纯化好的目标蛋白进行载量研究（结合模式）；

3.在线研究洗脱条件；

4.在线进行DoE实验。

这种方法是支持QbD的，96孔板筛选属性空间，DoE筛选设计空间和操作空间。所有步骤的DoE模型选择如图2。

图2 所有三步中选取中心复核设计（CCC）进行优化研究。这种高分辨率模型考虑了平方项的交互作用，星点消除了交互项和平方项的混淆。

在捕获这步中，我们选择Capto L填料。首先，通过96孔板进行宽泛的预洗和洗脱条件评估。然后，用纯化好的目的蛋白通过小柱进行载量研究。最后，对洗脱pH进行研究，优化出最佳洗脱pH。这对一些酸性敏感蛋白来说是尤为重要的。选用DoE（图2）筛选此步的最佳条件。

首先通过Capto L捕获大肠上清液中的Fab片段，然后再进行动态载量研究。所有试验均在装有预先平衡好的柱子并带有收集器的AKTA explorer 100系统上进行。在捕获工艺中，在保留时间4分钟条件下，Capto L的动态载量为21 mg/ml。通过pH6到pH2.5线性梯度洗脱筛选出洗脱pH为3.2。

接下来选择3因子进行DoE初筛试验，包括：预洗pH、预洗氯化钠浓度和洗脱pH。其它因子保持恒定，上样量15mg/ml填料（生产工艺典型上样量：动态载量的70%）；上样时保留时间为4分钟；预洗7 CV。研究过程中最重要的响应值为大肠细胞蛋白（ECP）含量和目标蛋白收率。图3为DoE结果。

SEC Yield                                                  ECP

图3 不同洗脱pH值等高线图（响应值为SEC测定的收率和ECP），最佳响应值的反应因子不一致：收率的最高值在右上角（预洗时高盐含量和高pH）；ECP的最低值在右下角（预洗时高盐含量和低pH）

用Sweet spot分析选取收率和ECP的综合最佳值（图4）。图中绿色部分为符合条件部分，然后我们选取了预洗缓冲液为pH 5，氯化钠为400 mM的醋酸盐进行工艺验证，结果符合预期：Fab收率为96%，ECP仅12ppm。

图4 在捕获工艺中Capto L的收率和ECP含量Sweet Spot分析图。要求标准：ECP含量2-30 ppm，收率95-100%。绿色部分为满足标准的条件。选取sweet spot中的一点进行工艺验证，结果：收率96%，ECP含量仅12 ppm。

在第二步纯化中，我们选择了具有高效的分离聚体和单体能力的高分辨率的阳离子交换介质——Capto SP ImpRes。穿透10%时的动态载量在pH为4.0和5.5下分别为80和71 mg/ml。在DoE试验中选取动态载量最低值来计算最大上样量，因此选取动态载量的70%（约50 mg/ml）作为试验的中心点，纯化缓冲溶液pH、氯化钠梯度和上样量作为反应因子，其它因子恒定（保留时间和缓冲液中氯化钠浓度）。

在AKTAexplorer 10系统上通过SEC柱（Tricorn 5/150）测定聚体含量。上样量为10 μl，流动相为PBS，流速为0.4 ml/min。紫外检测波长为215和280 nm。结果高收率和低聚体的最优条件不一致（图5）。高收率在图的上部（pH≥5.0），但低聚体含量在图的下部（pH≤5.0）。通过结合图上信息进行Sweet Spot分析，得到了宽泛的能满足所有标准（收率＞90%，聚体含量≤1%）的试验空间（图6）。

图5 在三种梯度长度条件下收率（左）和聚体（右）等高线图。为了得到较高收率一般会选择较高pH，pH4.5时CIP峰比较大（表明此条件下收率比较低）。Capto L洗脱液中聚体含量为3.5%，Capto SP ImpRes DoE结果表明：在较低pH值条件下聚体的去除能力较好，并且与上样量没有线性关系。由上图可以看出20 CV梯度洗脱时聚体值最低。

图6 洗脱梯度为20 CV时Sweet Spot分析图。图中绿色部分为满足条件（收率＞90%，聚体≤1%）的试验空间。为了进一步验证模型选取绿色部分一点进行工艺验证工作。当上样量为50 mg/ml、pH为5时，单体收率为94%，聚体为0.8%，ECP为7 ppm。

为了进一步降低杂质水平，在第三步采用了阴离子交换介质——Capto Q。高等电点的蛋白（比如此Fab片段）采用Capto Q穿透模式进行纯化是非常明智的选择。由于等电点接近8.5，在pH值为8或稍小于8时Fab片段将在流穿液中。

图7为收率和ECP的等高线图。高上样量时具有高收率，但pH和保留时间对收率几乎没有影响。随着pH的增加ECP降低程度也会增加，但保留时间和上样量对ECP没有影响。此步对聚体的降低没有显著影响（数据没有给出）。

第三步中采用Capto Q时，在比较宽泛的试验参数下Fab片段的收率均较高。在pH7.0-7.9时，ECP含量能降低1.2-1.45倍。

图7 Capto Q收率（左）和ECP（右）等高线图。只有上样量是显著影响收率的因子，上样量越大收率越高。DoE结果表明ECP含量与上样量和保留时间没有线性关系。只有pH是显著影响ECP的因子，pH越高ECP含量越低。

通过对以上三步的优化，我们更好的了解了每一步的显著影响因子，并做了工艺验证工作。三步验证工艺结果如图8和图9，并总结到表2中。工艺总收率为87%，聚体含量0.8%，ECP和内毒素显著降低，protein L配基脱落量在低限以下。

图8 工艺验证三步纯化层析色谱图。蓝线为UV，紫线为电导率，绿线为pH。

图9 Capto L洗脱液（蓝线）和终产品（红线）SEC分析标准化色谱图。

表2 工艺验证结果总结

成功的开发并验证了Fab抗体片段的三步法纯化工艺。每步收率在93%-97%之间，工艺总收率接近87%。聚体含量从3.3%降低至0.8%，ECP含量从起始样品中的400 000 ppm降至仅6 ppm，内毒素含量从1.7 百万EU/mg蛋白降至0.1 EU/mg以下，所有中间品的Protein L脱落配基在低限以下。

市场趋势表明开发抗体片段治疗性药物是未来发展趋势。GE生命科学部已经开发了Capto L、Capto ImpRes和其它Capto基质的层析介质来实现抗体片段的纯化平台。采用Capto基质层析介质进行三步Fab纯化工艺结果可以看出，其能有效的去除主要杂质。并且在整个工艺中配基脱落较少，收率较高。

参考文献

1 Data file: Capto L, GE Healthcare, 29-0100-08, Edition AB (2012).

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