摘 要：根据双水相萃取原理，探讨了乙醇-硫酸铵双水相体系对金针菇多糖的分配途径，并对该体系的双节线数据进行拟合，确定出拟合度高且参数较少的双节线方程：y=-5.83-64.76×0.95x，R2=0.999 1。以金针菇多糖萃取率为指标，研究系线长度、硫酸铵质量分数、乙醇质量分数对金针菇多糖的萃取效果。结果表明：在乙醇质量分数为24%、(NH4)2SO4质量分数为21%时，系线长度为47.36，多糖在下相的分配系数为10.57，多糖的萃取率可达92.24%。该法简单高效，可用于金针菇多糖的分离纯化。
关键词：金针菇；多糖；双水相萃取；分离纯化
金针菇[Flammulina velutipes(Curt·Fr) Sing.]为担子菌目金钱菌属植物，是一种药食两用菌[1]。主要成分有多糖、蛋白、黄酮、多酚及氨基酸等[2-4]。其中，多糖作为主要的有效成分之一，具有抗肿瘤[5]、抗氧化[6]、提高免疫力[7]等药理作用。目前，常用水提醇沉、纤维素柱层析等方法分离多糖。但由于存在技术缺陷[8]，现有文献报道的提取分离条件无法满足大规模生产的需求。
双水相体系(aqueous two-phase systems，ATPS)指2种亲水性化合物的水溶液在一定质量分数下混合后自发形成的2个不相混溶的水相体系。与常规的溶剂萃取原理类似，即目标物质在两相间的选择性分配，可能与分子间氢键作用、范德华力、疏水作用、界面性质等因素有关[9]。双水相萃取是一种新型液-液萃取分离技术，操作简单、分离效率高、分离条件温和且工艺容易放大，具备工业化分离天然产物的前景。目前，已有的萃取体系有高聚物-高聚物-水、高聚物-盐-水、离子液体-盐-水、小分子有机溶剂-盐-水等[10～11]，多用于蛋白质、酶、氨基酸、抗生素、黄酮等生物活性物质的萃取[12～16]，有关其在植物多糖萃取中的应用研究较少。
传统的萃取体系常以高聚物与盐配合形成，高聚物成本相对较高、难以回收再利用。若以低毒、廉价、易回收的乙醇与盐配合形成萃取体系，无疑将会降低萃取成本和毒性。因此，本实验考察利用乙醇-硫酸铵体系萃取分离金针菇多糖的工艺，并对该体系的双节线数据及液-液相平衡数据进行关联方程拟合，以此为基础探讨不同系线长度(tie line length，TLL)、乙醇浓度、硫酸铵浓度对金针菇多糖萃取效果的影响。
1.1 材料与试剂
金针菇由陕西众兴高科生物科技有限公司提供，50℃烘干至恒重，粉碎过20目筛。
(NH4)2SO4、无水乙醇，成都市科龙化工试剂厂；浓H2SO4，西陇化工有限公司；葡萄糖、蒽酮、3,5-二硝基水杨酸，国药集团化学试剂有限公司；丙三醇,广州光华科技股份有限公司；本实验所用试剂均为分析纯。
1.2 仪器与设备
UV-1800紫外-可见分光光度计，上海美谱达仪器有限公司；DK-S26电热恒温水浴锅，上海森信实验仪器有限公司；HC-3018R高速冷冻离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；电热鼓风干燥箱，上海实验仪器有限公司；高速万能粉碎机，北京中兴伟业仪器有限公司；RE-52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。
1.3 实验方法
1.3.1 金针菇多糖提取液的制备
称取100 g金针菇粉末，加1 000 mL蒸馏水沸水浴煎煮2次(每次30 min)，4层纱布过滤去除粗渣，滤液减压浓缩至约800 mL，7 000 r/min离心20 min去除沉淀，上清液定容至1 000 mL，4℃储存备用。
1.3.2 乙醇-硫酸铵双水相体系相图的绘制
常温常压下，以乙醇为有机相、(NH4)2SO4为无机盐，采用浊点滴定法[17]绘制相图：配制一定质量分数的初始(NH4)2SO4水溶液，缓慢滴加无水乙醇，不断摇匀，直至出现浑浊现象，记录所滴加乙醇的质量(mei)及体系总质量(mi)；再缓慢滴加蒸馏水，不断摇匀，至溶液澄清，记录所滴加蒸馏水质量(mwj)及体系总质量(mj)；反复操作，计算每次浑浊时乙醇及硫酸铵在总体系中的质量分数，如公式(1)和(2)：
(1)
(2)
式中：wi及ws分别为每次浑浊时乙醇及(NH4)2SO4质量分数；mei及mi分别为出现浑浊时所滴加的乙醇质量(g)及体系总质量(g)；ms为体系中硫酸铵质量，mj为体系澄清时体系总质量。
以(NH4)2SO4质量分数为横坐标，乙醇质量分数为纵坐标作图，即为该体系的相图，相图中的曲线即为双节线。
1.3.3 液-液相平衡数据的测定
在相图两相区选取3个点，将一定质量的乙醇、硫酸盐及水加入50 mL离心管中，振摇均匀，静置1 h后7 000 r/min离心10 min使分相完全，上下相中(NH4)2SO4的质量分数用甲醛滴定法测定[18]，乙醇质量分数通过气相色谱测定[19]，水的质量分数通过质量守恒定律计算得出。双水相体系的系线长度(TLL)及系线的斜率(S)通过公式(3)(4)计算得到：
(3)
(4)
式中：w1top，w1bot表示乙醇的质量分数；w2top,w2bot表示(NH4)2SO4的质量分数，top表示上相，bot表示下相。
1.3.4 双节线数据及液-液相平衡数据方程的拟合
应用Origin 9软件对双节线数据进行线性多项式拟合及非线性指数拟合，根据现有的经验方程用Othmer-Tobias方程[20]、Bancroft方程[21]对液-液相平衡数据进行拟合，以相关系数(R2)为指标筛选出拟合度高的双节线及两相平衡关联方程。
1.3.5 多糖质量浓度的检测
本实验采用蒽酮-浓硫酸法联合3,5-二硝基水杨酸(DNS)法测定金针菇多糖含量。蒽酮-浓硫酸法检测溶液中总糖的质量浓度，DNS法检测溶液中还原糖的质量浓度。
DNS试剂的配制[22]：精密称取3,5-二硝基水杨酸3.25g于500 mL容量瓶中，添加少量蒸馏水溶解，加2 mol/LNaOH水溶液162.5 mL，加入丙三醇22.5 g，摇匀，蒸馏水定容，于棕色瓶中4℃储存备用。
1.3.5.1 标准曲线的绘制
蒽酮-浓硫酸法：称取干燥至恒重的葡萄糖标准品1.000 0 g，蒸馏水定容至100 mL，配制成质量浓度为10 mg/mL标准储备液，精密吸取标准储备液1 mL，蒸馏水定容至100 mL，配置成质量浓度为0.1 mg/mL的葡萄糖标准品溶液。分别吸取标准溶液0、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、1.0 mL于5 mL比色管中，编号1～7，各加入4.0 mL 0.2%蒽酮-浓硫酸试剂，摇匀冷却后与沸水浴中加热5 min，冷却后用浓H2SO4定容到5 mL，静置10 min，以1号为空白，于波长620 nm处测其吸光度，以吸光度为横坐标，葡萄糖标品质量浓度(μg/mL)为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：y=26.433-0.0819，R2=0.999 4，在8.01～20.02 μg/mL内有较好的线性关系。
DNS法：精密称取干燥至恒重的葡萄糖标准品100 mg，蒸馏水定容至100 mL，配置成质量浓度为1.0 mg/mL的标准品溶液。吸取标准品溶液0、0.2、0.4、0.6、1.0、1.4、1.8、2.0 mL于10 mL比色管中，分别补加蒸馏水至2 mL，分别添加1.5 mL DNS试剂，混匀后沸水浴5 min，冷却后定容至10 mL，静置20 min，编号1～8，以1号为空白，于波长540 nm处测其吸光度，以吸光度为横坐标，葡萄糖标品质量浓度(mg/mL)为纵坐标绘制标准曲线，回归方程为：y=0.249 3x+0.006 6，R2=0.999 6，在0.02～0.2 mg/mL浓度有较好的线性关系。
1.3.5.2 样品总糖、还原糖质量浓度的测定
分别取1 mL体系上相十倍稀释液及下相百倍稀释液用蒽酮-浓硫酸法测定总糖质量浓度，分别取体系上、下相溶液1 mL用DNS法测还原糖质量浓度
多糖质量浓度/(mg·mL-1)=总糖质量浓度-还原糖质量浓度
(5)
1.3.6 双水相体系萃取条件的优化
根据乙醇-硫酸铵相图及液-液相平衡数据方程，考察不同系线长度对金针菇多糖萃取率的影响，并进一步研究乙醇及硫酸铵质量分数对萃取率的影响。
添加一定质量的乙醇、硫酸铵、金针菇提取液及蒸馏水于50 mL离心管中，配置成总质量为30 g的双水相体系，充分震荡，静置1 h后7 000 r/min离心10 min使分相完全，分别测定上下相体积及各相中多糖质量浓度，计算双水相体系的相比(R)、金针菇多糖分配系数(K)及萃取率，如公式(6)～(8)：
(6)
(7)
(8)
式中：R为体系下、上相的体积比；Vtop和Vbot分别为上下相体积(mL)；K为金针菇多糖在体系中的分配系数；Ctop和Cbot分别为上下相中金针菇多糖的质量浓度(mg/mL)；Y金针菇多糖在下相中的萃取率。
2.1 乙醇-硫酸铵双水相相图
乙醇-硫酸铵相图见图1，其中曲线ADB为体系双节线，为体系形成的临界线，单相区不分层，只有所选浓度在两相区才可分相，所选两相物质的质量分数为C点时，过C点的线段AB为该点的系线，BC、AC的线段长度比与上下相相比近似等于杠杆定律[23]，
即V上/V下=BC/AC，C点双水相体系仅有一条系线，该系线上各点为同一系线。一定范围内，系线越长体系分相能力越强。
图1 乙醇-硫酸铵双水相相图
Fig.1 Phase diagram of ethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system
2.2 双节线数据方程
对双节线数据进行关联，方程、参数及相关系数R2见表1。表1中所列均为筛选出的参数较少且拟合度高的方程，比较R2可见，非线性指数函数更符合该体系双节线，其中方程1、2、3、4、6拟合度较好，虽然方程1拟合度最高，但是参数较多，因此选择拟合度高、参数少且简单的方程6，即y=-5.83-64.76×0.95x为本实验的双节线方程，为后续试验条件的选择提供基础。
表1 乙醇-硫酸铵ATPs双节线关联方程模型及结果
Table 1 Correlation results of formula forethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system
注：w1、w2分别为乙醇、硫酸铵质量分数，a、b、c、d、e均为方程参数。
2.3 液-液相平衡数据方程
液-液相平衡数据、系线长度及斜率见表2和图2。可知各体系上下相中乙醇及硫酸铵质量分数坐标点均落在双节线上，各系线斜率基本一致，因此可根据系线斜率及相图方程计算试验组体系中上下相各相的质量分数，进而计算系线长度。利用经验方程Othmer-Tobias及Bancroft对数据进行关联，方程及参数见表3，可知2个方程相关性均较高，以lg[(1-w1top)/w1top]对lg[(1-w2bot)/w2bot]作图，以lg(w3bot/w2bot)对lg(w3top/w1top)作图，均呈线性关系，说明计算所测系线数据可靠。
表2 体系液-液相平衡数据
Table 2 Liquid-liquid equilibrium data forethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system
图2 乙醇-硫酸铵双节线及系线图
Fig.2 Experimentalbinodal and tie line length for ethanol-ammonium sulfate
表3 经验方程关联体系液-液相平衡数据结果
Table 3 Correlation results of Liquid-liquid equilibrium data for ethanol-ammonium sulfate aqueous two-phase system with empirical equation
注：w1、w2、w3分别为乙醇、硫酸铵、水的质量分数。
2.4 系线长度对金针菇多糖萃取率的影响
系线长度对金针菇多糖萃取率的影响见图3。选取不同系线上的中点，使各体系相比R约为1，此时两相体积基本相等，一般认为相比为1时萃取效果较好。体系分相后，上相为乙醇相，颜色较深，下相为(NH4)2SO4相，且多糖富集于下相，可能原因为多糖难溶于高浓度乙醇。系线越长体系中两相的分相能力越强，但随着系线长度的增加多糖在下相中的分配系数K及萃取率Y呈现出先增大后减少的趋势，在系线为54.02时达到最大，此时K=11.61、Y=91.46%，体系中乙醇浓度及(NH4)2SO4浓度分别为26.15%、20.85%。可能是因为系线越长下相中(NH4)2SO4的质量分数近饱和，体系中存在乙醇等其他物质与其争夺水分子，在系线大于54时下相中有(NH4)2SO4析出，(NH4)2SO4的析出降低了下相对多糖的溶解能力，从而使萃取率有所降低。因此有必要在此基础上，调节乙醇及(NH4)2SO4浓度，进一步优化萃取条件。
图3 系线长度对金针菇多糖萃取率、相比、分配系数的影响
Fig.3 Effect of tie line length on extraction rate, phase ratio, partition co-efficient forpolysaccharides from Flammulina velutipes
2.5 (NH4)2SO4质量分数对金针菇多糖萃取率的影响
固定乙醇质量分数为26%，在系线54.02及双节线之间选择7个不同(NH4)2SO4质量分数，考察其对金针菇多糖萃取率的影响，见图4。在所选择范围内，随着(NH4)2SO4质量分数的增加，多糖萃取率呈现出逐渐增加的趋势，且在浓度大于20%时增加趋势减缓。(NH4)2SO4浓度增加，下相中吸引水分子能力增强，使得下相与上相的相比R逐渐增大，但是大于20%时，下相中有(NH4)2SO4过饱和析出，因此固定乙醇质量分数为26%时，选择(NH4)2SO4质量分数为20%，在此条件下相比R为0.96，分配系数为11.60，萃取率为91.75%。
图4 (NH4)2SO4质量分数对金针菇多糖萃取率、相比、
分配系数的影响
Fig 4 Effect of concentrations of ammonium sulfate on extraction rate, phase ratio, partition co-efficient for polysaccharides from Flammulina velutipes
2.6 乙醇质量分数对金针菇多糖萃取率的影响
固定(NH4)2SO4质量分数为21%，在系线54.02及双节线之间选择7个不同乙醇质量分数，考察其对金针菇多糖萃取率的影响(见图5)。随着乙醇质量分数的增加，多糖萃取率呈现出先增加后减小的趋势，且在浓度为24%时达到最大，此时相比R为1.13、分配系数为10.57、萃取率可达92.24%。在20%～24%范围内，随乙醇质量分数增加，上相吸引水分子能力逐步增加，相比也因此减小，而上相乙醇浓度的增大也使多糖在上相中的溶解度减小，使分配系数增大，从而萃取率达到最大。但是当乙醇浓度进一步增大，乙醇对水分子的吸引能力也进一步增加，使得下相中硫酸铵过饱和析出，体系对多糖萃取效果降低。
综上所述，选择乙醇质量分数为24%，(NH4)2SO4质量分数21%为该体系萃取金针菇多糖的条件，此时系线长度为47.36、相比R为1.13、分配系数为10.57、萃取率为92.24%。
图5 乙醇质量分数对金针菇多糖萃取率、相比、分配系数的影响
Fig 5 Effect of concentrations of ethanol on extraction rate, phase ratio, partition co-efficient for polysaccharides from Flammulina velutipes
本实验选取乙醇及(NH4)2SO4作为双水相萃取体系的成相物质，通过测量各相中乙醇及(NH4)2SO4的质量分数发现两相中各物质的质量分数坐标点均落在双节线上，且两点之间的线段过初始浓度点，说明上下相又各自形成处于临界状态的微体系。又因为双水相体系的上下相之间的相比与BC、AC的线段长度比近似等于杠杆定律(图1)，所以可以通过相图、初始质量分数及所构建体系的相比推测体系液-液相平衡数据，比较计算值与实际测量值，发现二者基本一致。
对相图中的双节线数据方程进行关联拟合，有利于更合理地选择后续萃取条件。目前对乙醇-硫酸铵双水相体系双节线数据方程的拟合多套用以往通用的经验方程[24-25]，针对性较低，且相对标准偏差略大。本实验利用多种数学非线性指数模型对乙醇-硫酸铵双水相体系双节线数据进行关联拟合，筛选出多种双节线方程，对该体系专属性强，拟合度高。
采用响应面法优化双水相萃取条件可以取得理想的效果[26]，但选择合适的两相质量分数较困难，所需实验也较多。本实验首先考察系线长度(即分相能力)对萃取效果的影响，确定出萃取效果较好的各相质量分数。进一步调整(NH4)2SO4及乙醇质量分数，优化萃取条件，取得了理想的效果。
对于多糖含量的检测用蒽酮-浓硫酸法、苯酚-浓硫酸法[27]，测量值为样品中总糖的含量，常使结果偏大，影响准确性。本实验选择蒽酮-浓硫酸法联合DNS法测量多糖，排除了还原糖对测量结果的影响。实验发现，系线长度较小时，还原糖基本分布于上相，下相中含量极小。随着系线的增加，上相中的还原糖分配量也逐渐减少，下相中分配量保持不变，推测还原糖分布于中间杂质层。产生这种现象的原因有待进一步研究。
本实验对下相进行透析处理，去除下相中(NH4)2SO4，减压浓缩到一定程度后冷冻干燥，得到金针菇多糖，经检测所得金针菇多糖纯度为56.3%，远高于乙醇沉淀法所得的金针菇多糖纯度(19.4%)。金针菇中含有大量的蛋白等物质，使提取液颜色较深且浑浊。利用双水相萃取法在分离金针菇多糖时，乙醇相颜色较深，溶解了部分有色杂质。萃取体系分相且离心后，两相澄清，在两相中间有一层不溶物，呈白色胶絮状(非乳化层)。综上所述，双水相萃取法对金针菇多糖有较好的纯化作用，同时也可以去除还原糖、色素等杂质。
本实验探讨了乙醇-硫酸铵双水相体系对金针菇多糖的分配效果，并对双节线方程进行拟合，确定出拟合度高且参数较少的非线性指数方程：y=-5.83-64.76×0.95x为本实验的双节线方程。在乙醇质量分数为24%、(NH4)2SO4质量分数为21%时系线长度为47.36、分配系数为10.57的条件下，金针菇多糖萃取率可达92.24%。
利用双水相法萃取金针菇多糖时，多糖富集于下相硫酸铵水溶液中，该体系具有较好的除色素、除还原糖作用，且操作简便、试剂低毒廉价、目标产物易回收、适宜于大规模生产，具有较大的应用价值。
Isolation and purification of aqueous two-phase extraction of polysaccharides from Flammulina velutipes
ABSTRACT：Abstract: This study investigated the effect of ethanol-ammonium sulfate aqueous two phase system on the extraction and purification of polysaccharides fromFlammulina velutipes based on two aquous phase extraction. The experimental date of this system was simulated and the math model was established as y=-5.83-64.76×0.95x，R2=0.999 1. The effect of tie line length(TLL), concentrations of ethanol and ammonium sulfate on the extraction yield of polysaccharides from Flammulina velutipes was studied. The results showed the partition coefficient in lower phase and extraction yield of polysaccharides were 10.57 and 92.24%, respectively. The results showed that TLL was 47.36 when ethanol was 24% and (NH4)2SO4 was 21%. This method is simple and efficient and can be used for the isolation and purification of polysaccharides from Flammulina velutipes.
Key words：Flammulina velutipes; polysaccharides; aqueous two-phase extraction; extraction and purification
DOI：10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201705041
基金项目：陕西省科技统筹创新工程计划(No. 2015KTTSNY03-07)
收稿日期：2016-08-11，改回日期：2016-10-30
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