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研究DNA-蛋白互作?这些技术必须知道

小张聊科研 2020-05-21 13:17:57

上一期咱们侃了一通非编码RNA的研究技术,今天咱们来梳理一下DNA与蛋白质互作研究的技术们。

在许多的细胞生命活动中,例如DNA复制、mRNA转录与修饰以及病毒的感染等都涉及到DNA与蛋白质之间的相互作用的问题。近半个世纪以来, 前辈们在DNA-蛋白质复合物的构成和分解过程中进行了大量探索, 发展了一系列研究其互作关系的方法技术。


1.EMSA:凝胶迁移实验

实验目的】检测DNA与蛋白质的是否结合

凝胶迁移或电泳迁移率实验(EMSA:electrophoreticmobility shift assay)用于在体外研究DNA或RNA与蛋白质相互作用的一种特殊的凝胶电泳技术(上一期提到过)。

在凝胶电泳中,由于电场的作用,裸露的DNA分子向正电极移动距离的大小是同其分子量的对数成反比。如果该DNA分子可以和目标蛋白质结合,那么由于分子量的加大它在凝胶中的迁移作用便会受到阻滞,于是朝正极移动的距离也就相应的缩短,因而在凝胶中出现滞后的条带,这就是凝胶阻滞实验的基本原理。

 

2.EMSA升级版:DNA竞争实验

实验目的:检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位

DNA竞争实验(DNA competitive assay)是建立在传统EMSA实验基础之上的。

在DNA-蛋白质结合的反应体系中加入了超量的非标记的竞争DNA(competitor DNA),如果它同探针DNA结合的是同一种转录因子蛋白质,那么由于竞争DNA与探针DNA相比是极大超量的,这样绝大部分转录因子蛋白质都会被竞争结合掉,而使探针DNA仍然处于自由的非结合状态,可以在电泳凝胶的放射自显影图片上就不会出现阻滞的条带。


3.足迹实验(foot-printing assay)

实验目的:检测转录因子蛋白质同DNA结合的精确序列部位

当DNA分子中的某一区段同特异的转录因子结合之后便可以得到保护而免受DNaseI 酶的切割作用,而不会产生出相应的切割分子,结果在凝胶电泳放射性自显影图片上便出现了一个空白区,俗称为“足迹”。

这其实就很好理解了,拿DNA片段作为阳性对照,然后DNA和蛋白质结合之后作为实验组,同时让DNaseI进行随机切割,那么就会随机切碎,对照组和实验组一对比,只有结合部位的核酸不会显示出来,那就是蛋白质和DNA结合区。


4.甲基化干扰实验

实验目的:研究转录因子与DNA结合位点中的G残基之间的联系

甲基化干扰实验(Methylationinterference assay)是根据DMS(硫酸二甲酯)能够使DNA分子中裸露的鸟嘌呤(G)残基甲基化,而六氢吡啶又会对甲基化的G残基作特异性的化学切割这一原理设计的另一种研究蛋白质同DNA相互作用的实验方法。

应用这种技术可以检测靶DNA中G残基的优先甲基化,对尔后的蛋白质结合作用究竟会有什么效应,从而更加详细的揭示出DNA与蛋白质相互作用的模式。


5.染色质免疫共沉淀技术(ChIP)

实验目的:研究转录因子与DNA结合位点的序列信息

染色质免疫沉淀技术(chromatinimmunoprecipitation assay, CHIP)是目前唯一研究体内DNA与蛋白质相互作用的方法。

ChIP的一般流程:

甲醛处理细胞---收集细胞,超声破碎---加入目的蛋白的抗体,与靶蛋白-DNA复合物相互结合---加入ProteinA,结合抗体-靶蛋白-DNA复合物,并沉淀---对沉淀下来的复合物进行清洗,除去一些非特异性结合---洗脱,得到富集的靶蛋白-DNA复合物---解交联,纯化富集的DNA-片断---PCR分析

CHIP与其他方法的结合,扩大了其应用范围:CHIP与基因芯片相结合建立的CHIP-on-chip方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选;RNA-CHIP用于研究RNA在基因表达调控中的作用。


6.Southwestern杂交

实验目的:研究DNA的结合蛋白性质(分子量)

DNA-蛋白质印迹杂交, 即Southwestern印迹杂交(Southwestern Blot), 自1980年Bowen等创立以来, 已广泛应用于分子遗传学、分子生物学的诸多领域。将核蛋白粗提物进行SDS-PAGE电泳分析, 转膜后与同位素标记的特异DNA序列探针结合, 位点特异性DNA结合蛋白借助于氢键、离子键和疏水键结合DNA探针, 从而可通过放射自显影对DNA结合蛋白进行定性、定量分析。

 

当然还有一些冷门的新技术,但应用不多,不再赘述


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