学术报告 | Tarun M. Kapoor-- 化抗性为力量:利用细胞抗性指导化学抑制剂的设计,验证和应用

2023-05-10 14:56:27

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学术报告 | Tarun M. Kapoor-- 化抗性为力量:利用细胞抗性指导化学抑制剂的设计,验证和应用


     2018年3月1日,应生命科学联合中心王初研究员邀请,来自Rockefeller University 著名化学生物学教授Tarun M. Kapoor为大家做了题为“Leveraging resistance for chemical inhibitor design, validation and use”的精彩报告,报告在北京大学化学与分子工程学院A204报告厅进行。


     首先,王初研究员对Kapoor教授的求学和研究经历进行了简单介绍。Kapoor教授本科就读于California Institute of Technology, 1993年获得化学和生物学学位,博士就读于Harvard University,1998年获得化学博士学位,导师为Stuart Schreiber教授,之后在Harvard Medical School 进行博士后研究。2001年在TheRockefeller University开展独立科学研究工作,目前是The Pels Family Professor。

(TarunM. Kapoor,照片拍摄于慕田峪长城,2018年3月2日)


    Kapoor教授实验室的研究方向主要分为两个部分,一是开发化学探针研究动态的细胞生命过程,例如发展化学小分子抑制剂对细胞有丝分裂过程进行研究和调控,通过细胞表型的筛选和基于蛋白质靶点的理性设计发现新的小分子抑制剂。同时为了揭示小分子药物在细胞中的靶点蛋白质,Kapoor实验室开发了名为“DrugTargetSeqR”的技术,通过筛选鉴定出抗性细胞中所研究药物导致的基因突变,然后利用基因编辑技术对细胞进行相应的改造,以期重现该表型,完成金标准靶点验证(1)。另一方面是对细胞分裂系统进行重构,包括利用纯化蛋白质和显微成像技术等,期望揭示该动态过程的机理(2)。Kapoor实验室也试图结合化学蛋白质组学技术,高分辨显微成像技术和生物化学手段研究细胞中蛋白质的相互作用,例如开发了iCLASPI技术(3)。

     此次报告中Kapoor教授主要介绍了化学探针方面的工作,涉及了发现,验证和应用。Kapoor教授首先从重要的生物学问题入手,例如细胞骨架动力学过程,细胞分裂过程,这些都是在分钟甚至秒时间尺度上的过程,因此传统的生物学技术比如RNAi并不能很好的研究这些动态过程,而化学小分子抑制剂能够快速抑制靶点蛋白质活性,结合高分辨显微成像技术,非常适合研究快速变化的细胞过程。Kapoor教授以kinesin-5蛋白质为例,在可逆化学抑制剂的调控下,使用共聚焦显微镜能够实时监测细胞中心体的分离过程,发现该过程依赖kinesin-5的活性。

      然后Kapoor教授提出了一个问题,如何控制化学抑制剂的量使之能够成为一个探针或者药物?一般情况下,随着抑制剂浓度升高,靶点蛋白质活性抑制率相应增高,而其脱靶效应也会越来越显著,因此确定一个合适的浓度区间,保证该条件下有且仅有靶标蛋白质被显著抑制是最好的结果。Kapoor教授给出了一个可能解决方案即利用细胞对抑制剂产生的抗性。细胞在受到化学抑制剂处理时,会因为靶蛋白的活性受到抑制而表现出相应的浓度依赖表型,而有些细胞靶蛋白发生突变,造成抑制剂失效,因此突变细胞则没有对应的浓度依赖表型。这本是细胞为了“逃避”抑制剂而产生的抗性,Kapoor教授则利用此性质,如果在一定浓度区间内,野生型细胞响应抑制剂表现出相应的表型,而突变型细胞没有任何浓度依赖性响应,则说明该区间内抑制剂脱靶率很低。那么,如何找到相应靶蛋白突变型细胞呢?目前并没有有效的解决方法,一方面很难确定抑制剂的特异靶点蛋白,另一方面即使已知靶点蛋白质的结构,确定相应的突变也很困难。

     接着,Kapoor教授结合自己实验室的研究工作,对上述问题进行了一一阐述。酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)作为基因可操作性强的模式生物,已经在化学抑制剂抗性研究和靶点鉴定方面被广泛应用。类似的还有裂殖酵母(Schizosaccharomycespombe),经常被用于研究细胞周期等过程,但很少被用于化学小分子抑制剂的研究,因为该模式生物的多重耐药性(multidrugresistance, MDR)非常显著,能够使很多化合物失效。正是由于该特征,将MDR相关基因敲除后可以得到MDR-suppressed(MDR-sup)菌株,成为研究抑制剂抗性机理非常好的模式生物,Kapoor教授利用该菌株发现了第一例核糖体生物合成(ribosomebiogenesis)的小分子抑制剂,ribozinoindoles,具有高度选择性和细胞通透性(图1)(4)。在研究过程中,最关键的步骤便是对化合物的抗性进行系统的分析,通过对许多ribozinoindoles-resistant菌株进行测序分析发现基因Mdn1是突变位置,该基因编码大小约为540kD蛋白质,属于AAA+ATPase家族,是核糖体生物合成必需的。然后通过基因编辑技术对野生型细胞Mdn1进行突变后,发现可以产生同样的抗药性。体外单一蛋白质体系也证明了该突变对于抑制剂的特异性响应能力。因此,该研究非常确凿的发现了ribozinoindoles在细胞中的直接作用靶点,验证了上述思路的可行性。最新的实验进展发现该化合物及其类似物对人细胞没有毒性,但能够抑制真菌,目前该部分研究还在进行中。

图1真核生物核糖体生物合成小分子抑制剂,ribozinoindoles(Rbin-1)(图片来源于原文)


      Kapoor教授进一步将工作拓展至了人类细胞中,利用癌细胞对药物产生的抗性鉴定其靶点。目前最常用的靶点鉴定方法即将化合物改造为相应的探针,利用化学蛋白质组学技术对人细胞中蛋白质靶点进行全面的鉴定(5),然而该策略面临的最大挑战是如何尽可能保证探针和小分子具有同样效果。在人类细胞中利用抗性对靶蛋白进行鉴定的策略并没有被广泛应用的原因可能有以下三点,一是将细胞抗性导致的突变细胞分离出是很困难的,二是人类基因组很大,不像酵母等模式生物那样容易编辑,三是目前并不清楚由细胞抗性导致的靶蛋白基因突变的频率有多高。然而随着人类基因组测序工作的完成和测序技术的突飞猛进,该策略在人类细胞中实现的可能性变大。Kapoor教授首先利用目前已知靶点蛋白的小分子抑制剂进行了实验,结果与报道靶点相吻合。因此,Kapoor教授发展了名为“DrugTargetSeqR”的细胞内靶点鉴定方法。如图2,首先用一定浓度的化学抑制剂处理细胞,要求绝大多数,细胞在该条件下都会死亡,而能够存活下来的则是具有药物抗性的细胞。对这些细胞进行分离和培养,同时利用其它药物排除具有多重抗药性的细胞,最后得到抑制剂特异性的突变细胞,对这些细胞进行转录组测序,反复出现的基因变化则很可能是由于抗性导致的,被用于后续的验证。然后利用CRISPR-Cas9基因编辑方法对野生型细胞进行编辑,得到相应突变型细胞,如果该突变型细胞对抑制剂具有同样的抗性,则证明该蛋白质的确是其靶点,同时也可以进一步在体外条件下进行验证。

图 2 DrugTargetSeqR流程图(图片来源于文献6)


     利用DrugTargetSeqR策略,Kapoor教授对已知的一些抗癌药物进行了细胞内靶点确定,例如BI-2538,Velcade和Ispensib,同时发现一些靶点和之前的报道并不相符,例如已进入临床测试的抗癌药物YM155,该化合物能够引起DNA的损伤应答,而并非之前所报道的改变survivin蛋白质表达。该策略也被其它研究者所采用,取得了很好的结果。

       反过来,细胞抗性能否用来指导抑制剂设计呢?目前很多抑制剂的发现是基于蛋白质结构,但由于缺乏小分子和蛋白质相互作用结构信息,缺乏前体化合物以及蛋白质结构具有动态性,导致抑制剂的设计面临很大困难。Kapoor教授发现很多靶点蛋白质上都存在多个突变,而这些位点都发生在抑制剂与蛋白质的作用区域,因此,利用该信息可以预测抑制剂的结合位点,然后对周围位点进行突变,分析突变型蛋白质和抑制剂是否发生相互作用,最后借助于计算机模拟构建出完整的作用区域。Kapoor教授利用该策略成功开发了microtubule的化学探针,用于研究细胞有丝分裂过程。

      细胞对药物的抗性一直以来被认为是药物治疗过程中最大的问题,人们尝试用很多种办法去解决它,但很少有人试图去利用它做一些事情。Kapoor教授另辟蹊径,化抗性为力量,将其用于指导化学抑制剂的设计,验证和应用,更好的研究细胞的生命过程。更详细的研究内容可以参见最近的综述文章(6)和Kapoor教授实验室主页http://www.kapoorlab.com/。


参考文献:

1.    Kasap, C.; Elemento, O.; Kapoor, T. M.,DrugTargetSeqR: a genomics- and CRISPR-Cas9-based method to analyze drugtargets. Nature chemical biology 2014, 10 (8), 626-8.

2.    Shimamoto, Y.; Maeda, Y. T.; Ishiwata, S.;Libchaber, A. J.; Kapoor, T. M., Insights into the micromechanical propertiesof the metaphase spindle. Cell 2011, 145 (7), 1062-74.

3.    (a) Kleiner, R. E.; Verma, P.; Molloy, K.R.; Chait, B. T.; Kapoor, T. M., Chemical proteomics reveals a gammaH2AX-53BP1interaction in the DNA damage response. Naturechemical biology 2015, 11 (10), 807-14; (b) Kleiner, R. E.; Hang, L. E.; Molloy, K. R.; Chait, B. T.;Kapoor, T. M., A Chemical Proteomics Approach to Reveal Direct Protein-ProteinInteractions in Living Cells. CellChemical Biology 2018, 25 (1), 110-20.

4.   Kawashima, S. A.; Chen, Z.; Aoi, Y.; Patgiri,A.; Kobayashi, Y.; Nurse, P.; Kapoor, T. M., Potent, Reversible, and SpecificChemical Inhibitors of Eukaryotic Ribosome Biogenesis. Cell 2016, 167 (2), 512-24.

5.    WangC.; Chen N., Activity-based Protein Profiling. Acta Chimica Sinica 2015, 73(7), 657-68.

6.    Kapoor, T. M.; Miller, R. M., LeveragingChemotype-Specific Resistance for Drug Target Identification and ChemicalBiology. Trends in pharmacologicalsciences 2017, 38 (12), 1100-9.


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