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以小窥大→通过问题让你了解不可不知的代谢组学(上)

鹿明生物 2019-06-11 04:09:54


上期小鹿已经给大家展现了一下我们鹿明生物客户关注的一些常见蛋白组学问题,想要了解上期内容的可以戳这里(【独家秘笈】比知乎更强大的问答教你秒懂蛋白组学常见问题


如果你是蛋白学霸君可以了解我们这期内容向你的代谢学霸朋友们秀个优越,如果你是代谢学霸君你更不要错过这期干货啦,不然被蛋白君秀优越可就尴尬了。好了,话不多说,上干货!



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咨询于××天前代谢组学
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问题1:代谢组学主要的研究对象及研究目标有哪些?

答:代谢组学的研究对象主要是分子量小于1000Da的内源性小分子。

研究方向包括:全代谢组研究(对限定条件下的特定生物样品中所有代谢组分的定性和定量),靶向代谢组研究(对某个或某几个特定组分的分析),代谢轮廓分析(对少数所预设的一些代谢产物的定量分析),代谢指纹图谱分析(不分离鉴定具体单一组分,而是对样品进行快速分类),其中全代谢组和靶向代谢组研究是目前代谢组研究的主要方向。


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问题2:代谢组研究相对于基因组和蛋白质组研究而言有什么不同之处?

答:主要特点包括三方面:一、基因和蛋白表达的有效的微小变化会在代谢物上得到放大,从而使检测更容易;二、代谢组学的技术不需建立全基因组测序及大量表达序列数据库;三、因为代谢产物在各个生物体系中都是类似的,所以代谢组学研究中采用的技术更通用。


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问题3:代谢组的样品重复性有什么要求?

答:代谢组学基于多元统计分析方法进行的,在样品准备上相对于转录组和蛋白质组而言需要更多的重复数据。

一般建议植物样品最少6次,建议8次生物学重复。

模式动物及微生物样品最少8次,建议10次生物学重复。

临床样品30次生物学重复以上,如组织样品不好取样,可控制在20次重复以上。


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问题4:目前的主要代谢组技术有哪些?各有什么特点?

答:目前主要的代谢组技术平台主要有NMR(核磁共振)、GC-MS(气相色谱-质谱)、LC-MS(液相色谱-质谱)。

特点:①NMR技术具有无损伤性、无辐射性、无偏向性、方法灵活、处理简单等优点,但灵敏度较低、动态范围有限。

②GC-MS技术具有高分辨率、高灵敏度、有比较标准的数据库、易于定性等优点,但需衍生化、预处理繁琐。

③LC-MS技术具有灵敏度较高、较宽动态范围、无需衍生化等优点,但标准谱图库信息不全、不易定性。


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问题5:代谢组学在系统生物学中有什么作用?它的地位如何?

答:基于组学技术的系统生物学研究内容涵盖基因组学、转录组学、蛋白质组学和代谢组学。这几种组学的研究中,基因组学主要研究生物系统的基因结构组成,蛋白质组学研究有生物系统表达的蛋白质及由外部刺激引起的差异。系统生物学中,基因组学和蛋白质组学和告诉你可能发生什么而代谢组学则告诉你已经发生了什么。

代谢物作为生物体表型的基础能够帮助我们更直观有效地了解生命现象揭示生命本质。代谢组学本质上是指从整体上研究生物体的代谢物,是对某一生物、组织或细胞中的所有低分子量代谢产物进行定性与定量分析的一门科学。代谢组学以指标分析为基础,高通量检测为手段,通过研究生物体内代谢物的种类与数量及其变化规律来阐述机体在正常生命状态及环境变化后的代谢过程。代谢组是系统生物学的分支学科之一。目前,其研究内容主要包括对代谢物进行定性或定量分析,不同基因型的生物体进行代谢组学表型研究,不同生长环境及加物理、化学或生物性刺激后个体代谢产物的应答,进行代谢途径或代谢网络解析与转基因评价。


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问题6:动植物组织,细胞,血液,尿液等样本一般能搜到多少种代谢物?

答:代谢物在不同的样品中,种类各异,一般植物(20万种)、动物(2500种)、微生物(1500种)。在GC-MS平台:血液400左右,尿液600左右,动植物组织或细胞在500到1000+不等,与生物种类有关;LC-MS平台可以检测到的物质峰可以达到几千甚至上万,但是由于数据库的限制,目前都是做完差异分析后再做定性,一般禅意代谢物会控制在200个左右) 。


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问题7:代谢组可以精确描述样本内所有可能的代谢物吗?

答:目前由于分析技术上的局限性,尚未产生出一种分析技术可以精确描述样本内所有可能的化合物。鉴于这种分析手段上的欠缺,代谢组学的最终目标还只是科学家们的理想。各大分析仪器公司也都将代谢组学目标设定为今后研发的一个重要方向,随着分析技术的逐步进步,更精确更全谱的分析仪器将会逐步被研发出来,进而为代谢组学提供更强大的技术平台。


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问题8:如何选择实验平台?

答:代谢物分布广、性质差异大,单靠一种分离分析手段难以进行无偏向的全面分析,应根据样品的性质及研究目的来选择并综合利用多种技术平台。植物代谢物主要分为初生代谢物与次生代谢物两大类。进行初生代谢研究时大多使用GC-MS,进行次生代谢研究时,大多使用LC-MS,而LC-MS使用的物质范围则相对更为广泛一些。

 


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问题9:代谢产物分析有哪几种?代谢靶标分析和全代谢组分析区别?

答:根据研究的对象和目的不同,生物体系的代谢产物分析分为以下几个层次:

①代谢物靶标分析:某一个或某几个特定组分的定性和定量分析,如某一类结构、性质相关的化合物(氨基酸、有机酸、顺二醇类)或某一代谢途径的所有中间产物进行分析,不分离鉴定具体单一组分。

②代谢物指纹分析:同时对多个代谢物进行分析,不分离鉴定具体单一组分。

③代谢轮廓分析:限定条件下对生物体内特定组织内的代谢产物的快速定性和半定量分析。

④代谢组分析:对生物体或体内某一特定组织包含的所有代谢物的定量分析,并研究该代谢物在外界干预或病理生理条件下的动态变化规律。


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问题10:代谢组普筛研究一般每组多少个平行样本?为什么?

答:代谢物在不同组织样品中差异较大,为了可靠的统计学以及生物学分析,微生物与植物样本,每组最小样本数8个;模式动物最小样本数为10个;临床样本最小样本数为30个。


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问题11:代谢组生物统计学分析的方法和意义?

答:代谢组学本质上是指从整体上研究生物体的代谢物,是对某一生物、组织或细胞中的所有低分子量代谢产物进行定性与定量分析的一门科学。而对应的统计学分析属于统计学范畴,与代谢组学并无直接关系,但是可以通过统计学分析来判断样品的重复性、代谢物的差异以及进行遗传分析。因此,统计学分析结合代谢物组学并无严格限制。常用的统计学分析包括独立样本t检验、配对样本t检验、F检验、one-way ANOVA、Two-way ANOVA、PCA、PLS-DA、OPLS-DA、相关性分析、回归分析。此外,遗传连锁分析,全基因组关联分析,候选基因的全基因组关联分析等手段已广泛应用与功能基因组研究。


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问题12:质控样本qc的做法和意义。

答:代谢物检测质控主要是为了保证样品检测过程的准确性,对提取或检测过程中差异较大的样品或代谢物质进行分析判断。例如,检测100个样品中代谢物质,在提取样品之后,从100个样品中各吸取部分样品,先作为一个混和样品。随后,在100个样品的仪器分析的过程中,可以在每20个样品跑样过程中插入检测一个混合样品,最后通过分析混样在前后五六次代谢检测数据稳定性,判断样品的好坏。


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问题13GC-MS代谢组为什么要进行衍生化?

答:气相色谱仅适用于沸点低、热稳定性好的小分子物质的分离分析,对沸点高、挥发性低、热稳定性差、极性强甚至极易挥发的物质往往不能直接进样分析。生物样本中含有大量的羟基、胺基、羧基、巯基等官能团的物质信息,因此采用适当的衍生化处理方法对于样品的分离分析往往起着十分重要的作用。样品的衍生化方法的益处有:

(1)将一些不适合色谱分析的物质进行适当的化学处理转化成相应的挥发性衍生物,可以扩大气象色谱的测定范围;

(2)改变同分异构化合物的色谱性能,提高和改善样品的峰形和分离度,克服载体、柱壁对高极性、低挥发样品的吸附。甚至通过特殊的衍生方法,分离手性化合物;

(3)改善待测物质的热稳定性,以提高检测的灵敏度;

(4)改善待测物质的质谱行为,有利于鉴定化合物的结构。


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问题14:质谱的类型与选择?

答:色谱与质谱联用实现了从利用色谱进行物质分离到利用质谱进行物质鉴定的整个流程,且色谱,质谱的类型较为广泛。对于质谱而言,为了实现代谢物的定性与定量两个目的,应该选择不同的仪器进行综合分析。可以利用核磁共振质谱,高分辨的质谱与三重四级杆质谱一起进行定性分析;而定量分析利用基于三重四级杆系统的质谱如QTrap,则更为准确。常用的高分辨质谱有TOF-MS,Orbitrap-MS;三重四级杆系统的质谱主要为QTrap与3Q系统的质谱。


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世界没有悲剧和喜剧之分,如果你能从悲剧中走出来,那就是喜剧;如果你沉缅于喜剧之中,那它就是悲剧。



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