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基迪奥客户高分文章——代谢工程提高微藻产油量

基迪奥生物 2019-06-20 04:36:45

在能源物质短缺的时代背景下,生物能源也一直是生物领域的研究热点。当然,随着近年来美国页岩开采技术不断成熟,石油价格下跌,生物能源的研究热度有所降低。但从长远来看,石化能源作为不可再生能源,而且污染大,最终还是需要我们“大生物”学科一统江山。



在生物能源研究中,藻类个大、皮薄而且好生养。哦不对,换个说法,因为生长快,适应力强和产油量高,微藻一直是生物能源领域的研究热点之一。暨南大学李宏业教授通过操纵三角褐指藻脂类代谢通路中的关键基因6-葡萄磷酸脱氢酶(G6PD)的过表达,显著提高了三角褐指藻的脂类产量,是基因工程应用研究的精品之作。这篇研究最新发表在《Metabolic Engineering》(IF= 8.142)。


在文章机制研究部分,作者采用了蛋白质谱和代谢组检测的方法。基迪奥生物为该项目提供了蛋白质谱组学检测和个性化生物信息服务,助力客户论文发表。下面我们来看看这篇文章的研究脉络。


研究背景


三角褐指藻,参考基因组已经公布。基于基因组信息,研究者非常方便了解脂类代谢通路和关键调控基因,从而为藻类的精准改良提供了可能。因为脂类物质是还原产物,所以其从头合成需要持续消耗机体中的NADPH(还原型辅酶II)来提供还原力,将基团(CH3-CO-)还原为脂肪酸的酰基链(-CH2-CH2-)。但微藻产油的遗传和生化机制还未被完全揭示。


本研究将调控的重点放在磷酸戊糖途径(PPP),PPP可以产生NADPH和磷酸戊糖,在动物中可以提供肝脏中50%~75%的还原当量。PPP在NADPH合成和维持机体氧化还原平衡起着非常关键的作用。而G6PD是催化PPP途径中的上游基因,且在各个物种都已经被报道,是脂类合成的关键基因。因此,作者就以这个基因为操纵目标,最终显著提高了三角褐指藻的产油量。


文章脉络解析




这是一篇代谢工程类的应用型文章,所以文章脉络非常清晰,总的说来,就是谈了3点:


图1 文章主体脉络



1) 作者构建了一株三角褐指藻基因工程株系。

主要分析了目标基因prG6PD(三角褐指藻中的G6PD)的序列特点,并在构建基因转化株后通过定量分析证明了目标基因的表达量上升了。

2) 工程株系产油量提升,同时生理生化特性发生了一系列变化。

分析证明了工程株微藻含油量提升(正效应显著),但本身的生长和光合效率受的影响不大(副作用很小)。还通过代谢组分析了工程株的油脂成分变化。最后分析了工程株的形态变化,以及关键基因prG6PD的亚细胞定位。

3) 工程株微藻为什么产油量提高了?

进一步通过代谢组和蛋白质谱分析,观测prG6PD过表达后微藻整个代谢通路的变化,解析微藻含油量提升的分子机制。



1
目标基因的序列分析和转基因构建微藻工程株


首先作者对三角褐指藻G6PD(ptG6PD)进行了序列分析。目标序列的分析,在组学类文章里面经常会出现。例如,在植物DNA甲基化研究中,通常会分析该物种DNA甲基化相关酶的序列特性;在植物抗病研究中,会分析抗病基因(R基因)的序列结构特点等。在分析中,最常见的分析条目包括:结构域分析、多物种保守性分析以及基因进化关系分析。


比如在这篇文章正文中,作者分析了ptG6PD基因的结构域(图2A)和保守性。从中我们可以看出G6PD有两个结构域,其动植物种中非常保守。该基因如此保守,也间接暗示了其在脂类代谢中起着不可替代的作用。


备注:图B中的4个物种分别为三角褐指藻(ptr)、毛霉菌(Mci)、紫花苜蓿(Mtr)、小鼠(Mmu)。


图2 prG6PD的序列特性解析


然后作者构建prG6PD的过表达载体到三角褐指藻中,发现该基因的表达量和酶活都显著提高了——工程株构建成功。


图3 在两个转基因株中,prG5PD表达量提高了2.4 和2.7倍(A),且无论在光照还是黑暗条件下,酶活也提高了3倍以上(B)


2
工程株的生理生化特性解析


  • 产油量提升


转基因是否有效果呢?先看看含油量的变化。在生长稳定期(10天后),无论是单位培养基产油量(图4A),还是每百万细胞产油量(图4B),工程株的产油量都提高了数倍。但在生长早期(4天以前),产油量提高不明显。推测是由于这个时期藻细胞的生长旺盛,消耗了大量能量所致。


图4 工程株和野生型的生理生化特性比较


转基因虽然可以提高产油量,但如果影响了藻的生长和光合效率,显然就是个副作用。但相关指标表明,基因工程对藻的生长速率(图4C)和光合效率(表格请查阅原文)都没有受明显影响。


生物能源类的微生物,通常在应激条件下,会加速能量物质的累积。三角褐指藻在氮饥饿条件下,会进一步激活微脂类累积。通过实验发现,工程株在氮饥饿条件下,产油量也上升显著(图5)。


图5 正常条件和氮饥饿条件下的脂类累积量


  • 脂肪酸成分的变化


总含油量提升,那么油脂的成分又发生了什么变化呢?通过气相色谱-质谱分析(GC-MS)分析,发现了基因工程株生产的脂肪酸成分发生了明显的变化。总饱和脂肪酸(SUM SFA)略微提高,其中C16:0占的比例最大。总单不饱和脂肪酸(SUM MUFA)提高了58.5%,包括C16:1,C18:1提高明显。但总多不饱和脂肪酸(SUM PUFA)在基因工程株中降低了22.7%。


图6 脂肪酸成分的变化


  • 初生代谢物的含量也发生了变化


图7 初生代谢物的含量变化


总油脂含量提升,那么根据能量和物质守恒定律,是否是会导致其他能量物质合成减弱呢?答案是肯定的。通过检测,发现总脂类含量在两个工程株中显著提高,达到总干重的55.7%。但同时,工程株的总碳水化合物和蛋白含量降低了。这也说明,工程株中的能量和物质更多流向了脂肪酸合成。


  • 工程株的细胞形态变化


进一步,还需要观察含油量提升是否会改变微藻的细胞形态。通过激光扫描共焦显微镜观察,发现工程株(图8B)细胞大小和性状相比野生型(图8A)没有变化,但工程株的油体明显变得更加膨大了(图中细胞内部的圆形部分)。


图8 电子显微镜下野生型和工程株的细胞形态对比


  • PtG6PD的亚细胞定位


当然作为读者,我们还会关心ptG6PD的亚细胞定位。作者先通过在线工具分析预测PtG6PD的亚细胞定位。使用三种工具(Target P,PSORT II, Euk-mPLoc)预测亚细胞定位,发现在其可能定位位置可能为叶绿体和细胞质。进一步通过免疫电子显微技术,证明了ptG6PD主要定位主要在叶绿体(图9)。


图9 ptG6PD亚细胞定位于叶绿体


3
蛋白质谱和代谢组揭示基因工程微藻的代谢转化机理 


以上都只是观测微藻含油量提高了的整体现象,而还没有进一步揭示微藻含油量提升的分子机理,所以作者进一步采用蛋白质谱和代谢组技术来解答这个问题。


通过iTraq蛋白质谱分析,发现上调的通路包括:脂肪酸合成和代谢、PPP(磷酸戊糖途径)、TCA(三羧酸循环)、粘多糖代谢、能量代谢和氨基酸代谢等。同时,发生下调的通路包括:脂肪酸延伸、碳水化物代谢、核酸代谢、尿素循环和维生素循环。这些上调的通路有利于更多的碳流向脂肪酸合成以及脂类的累积。


而G6PD启动了磷酸戊糖途径的第一步,同时可以生成更多的NADPH用于脂类合成。代谢组分析也得出了与蛋白质谱相似的结论,包括PPP、糖酵解和TCA相关的代谢物发生显著的提升。


图10 没错,我们可以画这么牛逼的kegg电路图,将大量通路信息整合在一张图中


附加图 磷酸戊糖途径中,G6PD的确处于非常上游的位置


总结


1
文章的核心


这篇文章看起来结构简单,为什么能够发高分的期刊?我认为重要原因是这项研究作为生物工程类研究,属于偏应用型的研究。应用型的研究的关键是什么?有效啊。通过对G6PD的调控,三角褐指藻的产油量确确实实地提高了,这是关键中的关键。这是这篇文章能够发表《Metabolic Engineering》的关键(合成生物和代谢工程类的顶级期刊了)。剩下所有的机制研究,就都是锦上添花(当然也必不可少)。


2
文章如何可以更上一层楼?


这篇文章如果要更上一层楼,有两个地方可以改进。


  1. 这篇文章的机制研究部分还有很多问题没有回答。一些细节问题,例如脂肪酸的成分为什么会发生变化,其成分变化对产量变化有何影响。如果这些问题被详细回答,无疑结果会更加有趣(有应用价值,有具体机制)。

  2. 如果这是篇基因组文章?

    当然,三角褐指藻基因组早已公布。但如果,我们假设三角褐指藻基因组没有公布,这篇文章是“三角褐指藻基因组 + 代谢工程”,从基因组数据中挖掘确定G6PD为脂类关键调控基因(哪怕是你早已知道这个结论),再通过代谢工程加以验证,那么就是通过基因组技术解决一个具体的应用型问题,那整个基因组文章的高度立刻就提升了。保守至少也是一篇《nature communication》,如果机制讨论的漂亮,还可以是《nature biotechnology》。这个角度,对从事能源植物/微生物基因组研究的老师,也是一个借鉴的方向。


3
关于代谢组技术的生物学重复数的问题


文章中的组学部分,都是使用质谱类技术(蛋白质和代谢组)。不少老师对代谢组的重复数一直有疑问。不同代谢组公司给出的建议不同(3个、6个、10个都有),导致老师们晕头转向,不知如何是好。对于生物学实验类的问题,答案背后的逻辑比答案本身更重要。生物学重复的目的是什么?目的是:从生物学随机误差的背后找出真正有差异的物质


在某些代谢组实验中(例如,疾病研究中的病例-正常人比较),由于样本本身的多样性极高(不同年龄、性别、饮食习惯、健康水平),加上代谢组本身波动比较大,如果很低的重复数,则根本无法从一堆随机误差中找出真正差异显著的代谢物。但如果样本本身一致性好,实验处理稳定,那么较低的重复数也可以保证可以找出差代谢物。


例如在这个实验中,样本的实验条件本身处于严格控制下。加之,对于微生物、微藻、浮萍等个体较小的物种,本身每一个生物学重复都是大量个体的混合样,这更进一步降低了生物学重复间的遗传差异(其实,其他植物、动物也可以借鉴这个策略,减少遗传背景差异的影响)。所以,使用3个生物学重复,就足以检测差异代谢物,一样可以发表《Metabolic Engineering》这样的权威期刊。


4
补充一点


敲黑板,这是此篇微信文章的重点:

基迪奥生物具备完备的多组学解决能力,我们能够为你提供准确、专业的蛋白质谱(itraq,TMT,label free等)、代谢组(非靶向全谱代谢组、广泛靶向全谱代谢组、靶向代谢组、脂质组、代谢流分析等)整体解决方案,助你多发SCI,走向人生巅峰