Western Blot的原理及步骤

 

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Western Blot的原理及步骤

免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。Western Blot是检测单一细胞蛋白表达量最好的方法；若要对表达蛋白进行细胞定位，confocal应是首选的方法，若要进行蛋白相互作用的关系，应考虑免疫共沉淀技术。

一、Western Blot的原理
Western Blot与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。

二、操作步骤
（一）蛋白质样品获得：
1.所需试剂：
(1)蛋白酶抑制剂mix：

  hjjhh储存浓度 5ml mix中的加入量 终浓度   
*PMSF（溶于乙醇） 100mM 25ul 50uM   
*Trypsin Inhibitor 1mg/ml 250ul 50ug/ml   
*EGTA（pH8.0） 0.5M 80ul 8mM   
*EDTA（pH8.0） 0.5M 10ul 1mM   
Aprotinin 1mg/ml 25ul 5ug/ml   
Pepstatin（溶于乙醇） 0.2mg/ml 50ul 10ug/ml   
Leupeptin 5mg/ml 100ul 0.1mg/ml   
Benzamidine 100mM 250ul 5mM   
NaF 5M 250ul 250mM   
NaVO4（FW183.8） 0.2M 25ul 1mM 
注意：*代表必须加的试剂
(2)细胞裂解缓冲液(培养细胞用)：1% NP40, 25 mM Hepes。配制1M DTT溶液，保存在-20℃冰箱中。
配制细胞裂解液（现用现配）： 将裂解缓冲液和抑制剂溶液等体积混合，然后加入DTT溶液，使其浓度为1 mM。
（3）RIPA(组织样品)：1×PBS，1％NP-40，0.5%脱氧胆酸钠，0.1% SDS。（蛋白抑制剂在提取蛋白时现加，按10ul/ml RIPA的量加10mg/ml PMSF，Aprotinin按30ul/ml RIPA的量加入）
也可用样品裂解液：（2%SDS；0.01%溴酚兰；10%甘油；60mmol/LTris-HCl(PH6.8)；        100mmol/LDTT(取自-20℃存放的1mol/L储存液，临用时加入)
2.细胞裂解步骤
将所有的样品放在冰上
1. 4℃离心5min沉淀细胞
2. 去掉上清
3. 将细胞重悬于1ml冰冷的PBS中，4. 转到离心管中
5. 4℃离心5min，
6. （除去样中微量血清）      
7. 除去上清
8. 置细胞沉淀于冰上
9. 每107cells加裂解工作液100ul，10. 轻轻重悬细胞沉淀
11. 置冰上20min
12. 13000rpm离心15min，13. 4℃
14. 将上清转到小离心管中（将管盖扎上针孔）
15. 取出1ul，16. 用于Bradford测定
17. 液氮速冻样品，18. -20℃保存
3.组织裂解
（1）3ml冰冷的RIPA缓冲液匀浆1g组织,每克组织加30ul 10mg/ml PMSF
（2）所有步骤均在4℃下进行,匀完浆后冰上放置30min.，4℃10000×g离心10min，取上清（如果无法沉淀，请加大离心力，操作40min之后需要再加PMSF，加量同1，如信号转导、转录因子类蛋白易降解，可添加Aprotinin、Benzamidine、NaVO4等蛋白酶抑制剂）；有些蛋白可能存在于沉淀中（Triton不可溶的蛋白多数是SDS加热可溶的），因此要保留沉淀，沉淀用RIPA清洗几次后，保存，电泳前变性处理时要额外加入      SDS，因为沉淀蛋白多数是SDS加热可溶蛋白。）加热100°5分钟直到变性，－20°冰箱保存。
4.培养细菌：
细菌诱导表达后，可通过电泳上样缓冲液直接裂解细胞，真核细胞加匀浆缓冲液，机械或超声波室温匀浆0.5-1min。然后4℃，13,000g离心15min。取上清液作为样品。

（二）Bradford法测定蛋白（考马斯亮蓝G－250染色法）
1) 配制染液：
² 考马斯亮蓝G-250   10mg
² 95％乙醇           5ml
² 85％磷酸           10ml
蒸馏水补足体积至       100ml
2) 标3) 准蛋白质：在1.5ml离心管中加入BSA蛋白0、10、20、30、40、50、60ug，4) 补水至60ul，5) 加1ml染液，6) 混匀后在5－7) 15min之内，8) 595nm处比色测定。
9) 测定样品：方法同10) 2）
方法：Bradford法测定蛋白浓度（目前动物所用方法）
（1）取微量离心管（0.5ml），编号；
（2）取样品30ul，分别加入3只离心管中（每只10ul），每只离心管中加水290 ul，总体积300 ul；
（3）加入不同浓度的（10ug/），制备标准品；

 
 BSA(ul) 水  BSA(ul) 水   
S0 0 总体积至300 ul S5 5 总体积至300 ul   
S1 0.1 总体积至300 ul S6 10 总体积至300 ul   
S2 0.5 总体积至300 ul S7 20 总体积至300 ul   
S3 1 总体积至300 ul      
S4 2 总体积至300 ul    
加入Bradford液100 u（样品和标准品都加），混匀（旋涡振荡），取200－300 ul，加入酶标板中，用酶标仪与595nm处测定，打印数据。

（三）SDS-PAGE
1、SDS-PAGE试剂
（1）30%储备胶溶液：丙烯酰胺（Acr）29.0g，亚甲双丙烯酰胺（Bis）1.0g，混匀后加ddH2O，37OC溶解,定容至100ml, 棕色瓶存于室温。
（2）1.5M Tris-HCl(pH 8.0)：Tris 18.17g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至8.0,定容至100ml。
（3）1M Tris-HCl(pH 6.8)：Tris 12.11 g加ddH2O溶解, 浓盐酸调pH至6.8,定容至100ml。
（4）10% SDS：电泳级SDS 10.0 g加ddH2O 68℃助溶,浓盐酸调至pH 7.2,定容至100ml。
（5）电泳缓冲液(pH 8.3)：Tris 3.02 g，甘氨酸 18.8 g，10% SDS 10ml加ddH2O溶解, 定容至1000ml。
（6）10%过硫酸铵（AP）： 1gAP加ddH2O至10ml。
（7）2SDS电泳上样缓冲液：1M Tris-HCl (pH 6.8)2.5ml，b-巯基乙醇1.0ml，SDS 0.6 g，甘油 2.0ml，0.1%溴酚兰 1.0ml，ddH2O 3.5ml。
（8）预染marker.
2、SDS-PAGE步骤
（1）制胶
分离胶：制备聚丙烯酰胺分离胶20ml，凝胶浓度为10%。将分离胶注入准备好的干净玻璃板间隙中，在其顶层覆盖数毫升水，以加速聚合，待分离胶聚合完全后（约30 min），倾出覆盖液体，用去离子水洗涤凝胶顶部数次以去除未聚合的丙烯酰胺，尽可能去除凝胶上的液体，再用纸巾的边缘吸净残余的液体。（最好用1ml的枪头加）
浓缩胶：制备8ml 5%浓度的聚丙烯酰胺积层胶，直接灌入已聚合的分离胶上，插入梳子，垂直放置于室温。在积层胶聚合完全后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽，上下槽加入1×电泳缓冲液（25 mM Tris-Cl, 250 mM甘氨酸，0.1%SDS）,按次序上样（100mg）,在所有不同的孔中加入等体积的1×SDS凝胶加样缓冲液。
加入电流缓冲液：上槽液与下槽液一定不要在同一水平线，以免短路。
电泳：跑到底
注意：（1）上样缓冲液可按我们的方法进行；
（2）目前动物所用的是BioRad的产品，加样量很少，两块胶只需10ml；
（3）蛋白质分子marker用western  blot预染marker（也可在转膜后用丽春红，然后洗掉，但由于丽春红致癌，目前都不用之）。

（四）电转移
1.设备和试剂
（1）小型电转移槽：BioRad产品。
（2）NC或PVDF膜
（3）3mm滤纸（其它的滤纸也可以，但硬度差一些）
（4）钢片尺一把（带刻度的）
（5）转膜缓冲液：甘氨酸 2.9g；Tris 5.8g；SDS 0.37g；甲醇200ml；加ddH2O定容至1000ml
2. 电转移步骤
安装转膜电泳装置
（1）取下凝胶，切取有效部分（按Marker除去无关凝胶和未使用的泳道，将凝胶做好标记以确定第一条泳道去向），用钢片尺确定胶的大小，剪同凝胶一样大小的2张3mm滤纸和1张硝酸纤维素膜（可以不管海绵大小），并将胶在缓冲液中浸泡适当时间；
1) 将硝酸纤维素膜浸在甲醇中2秒，2) 然后转到印迹缓冲液中
3) 将滤纸也浸一下印迹缓冲液
4) 安装如下
 
 红色电极（＋） 电场 蛋白转移   
层6 白色栅＋海绵     
层5 3mm滤纸（三张）     
层4 硝纤膜     
层3 凝胶     
层2 3mm滤纸（三张）     
层1 黑色栅＋海绵     
 黑色电极（—） 0  
（注意：将所有的气泡赶走）
黑色电极（—）（黑色栅＋海绵）－3mm滤纸－凝胶（带有marker标记的一面）－硝纤膜－3mm滤纸－白色栅＋海绵
5) 将槽中注入印迹缓冲液，6) 安上冰盒（另外，7) 必须将整个转膜装置于冰上，8) 可以用盆子装上冰，9) 使其在电泳时始终处于低温状态）
10) 75V 1-1.5h，11) 或15V过夜（4℃）。
12) 取下硝纤膜
注意：（1）最好装两块以减少电阻；
（2）根据我们实验室的现状，可以在预染marker的相应位置将胶切下，然后再转；但是在切胶前一定要用转膜液润湿，防止胶破裂；
（3）转膜时，只要胶、膜、滤纸的大小相近就可以了；
（4）以上操作必须带手套操作，为了防止污染，最好在一次性手套的外面带无粉乳胶手套，以防污染。
（五）免疫反应
所需试剂和设备：
1、PBST：1000ml 0.01M PBS(pH7.4)加0.5-1ml Tween20（最好用进口的）。
2、封闭液：20 ml PBST加1.0g脱脂奶粉。
3、ECL试剂盒
4、暗盒：

 
名称 X射线摄像暗匣   
型号 Ax-1   
规格 203mm×254 mm(8×10英吋)   
厂家 中国广东粤华医疗器械厂 
5、胶片：医用X射线胶片（koda）
6、压片法：①暗盒一个；②柯达医用胶卷；③显影液（储存于4℃，用时加）④定影液（可在室温保存）⑤去离子水冲洗（用洗瓶）。③④⑤应单独用一盒子
根据膜上的分子标记剪下目的蛋白所在的大致条带，然后进行下面的操作。
非特异性封闭（针对多抗）
² 封闭液：含5%脱脂奶粉的PBST
² PBST：PBS＋0.05％－² 0.1％Tween20 pH7.4
（ 0.02％叠氮钠（Na2N3）可以加入，防止生菌，一般不加）
a) 将转移完毕的硝纤膜放在可热封的塑料袋中（杂交袋或保鲜袋）
b) 按1cm2面积加0.1ml封闭液注封闭液（约3－c) 5ml）
d) 除去气泡，e) 热封塑料袋
f) 室温下摇动1－g) 2h，h) 或4℃摇动过夜
注意：封闭可以不在塑料袋中进行，因为封闭液不贵。
磷酸化蛋白最好不用脱脂奶粉，用2%Tween20＋3%BSA)
加1抗
a) 将袋打开，b) 倒掉封闭液
c) 按0.1ml/cm2加入1抗,,一抗的浓度一般应为1：200－d) 1:1000，e) 用时用抗体稀释液（鼎国有售）或封闭液稀释。
f) 除去气泡，g) 封闭袋口
h) 摇动2h或4℃摇动过夜（效果更好）
注意：（1）一般加1－2ml，最好封闭过液；
（2）这一步必须在塑料袋中进行，否则太浪费抗体。
加2抗（联hr-peroxidase/HRP）
a) 打开袋子，b) 除去1抗（该1抗如果加入叠氮钠，c) 可以于4℃放置1个月）
d) 置于平皿中（摇床上），e) PBST洗3次，f) 每次5min（该PBST不g) 能含叠氮钠，h) 有叠氮钠时，i) 会抑制HRP活性）
i) 倒掉洗液，j) 加2抗（溶于含5％脱脂乳的PBST中，k) 无叠氮钠或用时用抗体稀释液（鼎国有售）或封闭液稀释。（二抗浓度1：1000－l) 10000）
j) 室温下摇动平皿1－k) 2h。
注意：（1）一般加1－2ml；
（2）这一步必须在塑料袋中进行，否则太浪费抗体。
1抗、2抗均可回收，重复利用。
酶反应 （Pierce发光系统）
a) 除去2抗溶液，b) 用PBST洗3次（在摇床上），c) 每次10min（室温）（很关键）
d) 1.1混合底物A和B，e)  （置于平皿中)
f) 将底物混合液放在膜上孵育1-5min（室温），g) 除去发光底物，h) 在黑暗中，i) 观察染色情况。
显色曝光
设计暗室一个（用窗帘封闭即可），加入ECL试剂后，将膜置于暗盒中，在膜上加一保鲜膜，用透明胶将膜固定，然后关闭电灯开关，剪一胶片盖在膜上，关闭暗盒，曝光（开始曝光时间可以短一些），然后放入显影液1－5min（通常第一次曝光1min就可以），然后放入定影液中，此时可以打开灯观察结果。
暗室中，将酶反应后的膜放带有增感屏的盒中，切一个适宜大小的X光片，放在膜上曝光1－5min，，然后根据需要适当延长曝光时间。（发光时间大约是1h）
取下胶片，显影和定影，显影液中1－5min，定影液中1－5min，一定要注意显影液的时效。
有关结果的处理：一般来讲，可以在加入ECL试剂后，在暗环境中观察到结果，此时可在进行曝光。曝光时间长，胶片会出现一片黑，此时可以缩短曝光时间，可以得到较清晰的结果；有时结果中会出较强的非特异性染色，此时可以略等一会，再让膜曝光，可以明显减少非特异性染色。

奥青生物
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