关注公众号,更多干货和惊喜好礼
蒋好博士、汤海平博士
赛默飞大分子应用工程师
生物体内的蛋白质通过空间结构和三维组装发挥着多种多样的功能,因此研究蛋白质及其复合物的结构与相互作用是非常重要的。近些年,生物质谱的进步对推动蛋白质结构领域的研究有着显著的影响,使得传统的结构生物学研究有了更多的研究手段。质谱方法的多样性来源于质量分析器的改进、硬件性能的提升(扫描速度、分辨率和选择性)以及质谱碎裂方式的多样性。结合在蛋白水平和肽段水平的不同质谱分析方法,使得通过质谱对生物大分子结构的表征成为可能。
在蛋白水平上的研究,可以通过非变性质谱技术(native MS)分析蛋白-蛋白或蛋白-配体复合物之间的结合,来解析完整蛋白在其天然状态下的组装形式。非变性质谱的一个很好的应用实例是:牛津大学Carol V. Robinson教授去年发表在Science Advances上的文章[1],该文章主要运用Orbitrap质谱仪研究天然状态下的GPCR与配体间的非共价结合(图1)。详细的质谱分析方法请参照Carol V. Robinson教授2016年发表在Nature Methods上的文章[2]。
图1 天然状态下的GPCR P2Y1R与配体ADP非共价结合的原始质谱图
在肽段水平上的研究,常规基于液质联用的串联质谱技术能够提供蛋白质及其亚基的氨基酸序列信息。限制性蛋白水解和表面标记技术,如氢氘交换(HDX-MS,图2),已经被成功地应用于监控目标蛋白体系的构象变化和表征蛋白-蛋白相互作用界面。HDX-MS的原理是利用氘原子标记蛋白质骨架中氨基上的氢原子来记录其标记或是交换效率,理论上来说,来自蛋白质相互结合区域的氨基基团,比起其他区域会更难以被溶液中的氘原子进攻,直观上能够得到不同的标记或者交换效率,而这样的现象也能够被质谱检测来提供有效的结构信息。
图2 赛默飞氢氘交换质谱(HDX-MS)完整分析流程
交联质谱技术(XL-MS,图3)利用化学交联剂将天然复合物中的蛋白质不同相互作用位点(通常为氨基酸侧链)连接在一起,用质谱的强大序列解析能力来识别交联的位点,从而获取拓扑结构信息,以揭示潜在的蛋白结构域。
图3 赛默飞化学交联质谱完整分析流程
近年来,随着在样品制备、显微镜、检测器、数据采集自动化以及图形处理等方面的进步,冷冻电镜技术(cryo-EM)逐渐有取代传统结构生物学分析工具之势,如X射线晶体衍射和核磁共振成像。冷冻电镜的优势在于能够稳定重复地直接对完整的大分子复合物实现接近原子分辨率的可视化,而不仅仅是选中的某个区域。
因此,在面对生物体系中十分复杂且动态变化的复合物结构研究中,需要结合许多互补的分析技术和手段,比如MS和cryo-EM,发展出综合性的结构生物学研究方法(图4)。
图4 综合性的结构生物学分析方法
这种综合性的学科分析方法的一个很好的例子就是去年发表在Science期刊文章[3],利用结构蛋白质组学中的质谱工具来研究KaiA,KaiB和KaiC(蓝藻昼夜节律生物钟的基本组成蛋白)的拓扑结构和化学计量学,以及监控这些精密组合的组装体构象变化,同时利用单颗粒cryo-EM对其结构进行表征(图5)。
图5 KaiCBA复合物的冷冻电镜图和模拟原子模型
参考文献
[1] H.Y. Yen, J.T.S. Hopper, I. Liko, T.M. Allison, Y. Zhu, D.J. Wang, M. Stegmann, S. Mohammed, B.L. Wu, C.V. Robinson. Ligand binding to a G protein–coupled receptor captured in a mass spectrometer. Science Advances. 2017; 3: e1701016.
[2] J. Gault, J. A. C. Donlan, I. Liko, J. T. S. Hopper, K. Gupta, N. G. Housden, W. B. Struwe, M. T. Marty, T. Mize, C. Bechara, Y. Zhu, B. Wu, C. Kleanthous, M. Belov, E. Damoc, A. Makarov, C. V. Robinson, High-resolution mass spectrometry of small molecules bound to membrane proteins. Nature Methods. 2016; 13, 333-336.
[3] J. Snijder, J.M. Schuller, A. Wiegard, P. Lössl, N. Schmelling, I.M. Axmann, J.M. Plitzko, F. Förster, A.J. Heck. Structures of the cyanobacterial circadian oscillator frozen in a fully assembled state. Science. 2017; 355(6330):1181-1184.
若需要了解更多产品信息
请扫描以下二维码
我们将第一时间与您联系!
更有机会赢取精美礼品❤
Copyright © 2023 All Rights Reserved 版权所有 福建水产设备联盟