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【经典实验】蛋白质免疫印迹(WB)

佑研匠簇 2018-11-08 14:58:46


蛋白质免疫印迹



蛋白质免疫印迹(Western Blot,简称 WB)可以:


1. 从蛋白质混合物中检出目标蛋白质;

2. 定量或定性确定细胞或组织中蛋白质的表达情况;

3. 用于蛋白质-蛋白质、蛋白质-DNA、蛋白质-RNA 相互作用后续分析。



实验原理


WB 是将蛋白质转移到膜上,然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白,可用相应抗体作为一抗进行检测,对新基因的表达产物,可通过融合部分的抗体检测。


与 Southern 或 Northern 杂交方法类似,但 WB 采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳,被检测物是蛋白质,「探针」是抗体,「显色」用标记的二抗。


经过 PAGE 分离的蛋白质样品,转移到固相载体(例如硝酸纤维素薄膜)上,固相载体以非共价键形式吸附蛋白质,且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原,与对应的抗体起免疫反应,再与酶或同位素标记的第二抗体起反应,经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。



实验步骤


一、试剂准备


1.  SDS-PAGE 试剂:见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。


2.  匀浆缓冲液:1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml;10%SDS 6.0 ml;β- 巯基乙醇 0.2 ml;ddH2O 2.8 ml。


3.  转膜缓冲液:甘氨酸 2.9 g;Tris 5.8 g;SDS 0.37 g;甲醇 200 ml;加 ddH2O 定容至 1000 ml。


4.  0.01 M PBS(pH7.4):NaCl 8.0 g;KCl 0.2 g;Na2HPO4 1.44 g;KH2PO4 0.24 g;加 ddH2O 至 1000 ml。


5.  膜染色液:考马斯亮兰 0.2 g;甲醇 80 ml;乙酸 2 ml;ddH2O118 ml。包被液(5% 脱脂奶粉,现配):脱脂奶粉 1.0 g 溶于 20 ml 的 0.01 M PBS 中。


6.  显色液:DAB 6.0 mg;0.01 M PBS 10.0 ml;硫酸镍胺 0.1 ml;H202 1.0 μl。


二、蛋白样品制备


此处内容较多,有部分实验步骤省略,想查看更多详情,请点击【阅读原文】查看。


1. 单层贴壁细胞总蛋白的提取


① 倒掉培养液,并将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液(或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走)。


② 每瓶细胞加 3 ml 4℃预冷的 PBS(0.01M pH7.2~7.3)。平放轻轻摇动 1 min 洗涤细胞,然后弃去洗液。重复以上操作两次,共洗细胞三次以洗去培养液。将 PBS 弃净后把培养瓶置于冰上。


2.   组织中总蛋白的提取


① 将少量组织块置于 1~2 ml 匀浆器中球状部位,用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。


② 加 400 μL 单去污剂裂解液裂(含 PMSF)于匀浆器中,进行匀浆。然后置于冰上。


三、 蛋白含量的测定


此处内容较多,有部分实验步骤省略,想查看更多详情,请点击【阅读原文】查看。


1.  制作标准曲线


① 从-20℃ 取出 1 mg/ml BSA,室温融化后,备用。


② 取 18 个 1.5 ml 离心管,3 个一组,分别标记为 0 mg,2.5 mg,5.0 mg,10.0 mg,20.0 mg,40.0 mg。


2.  检测样品蛋白含量


四、SDS-PAGE 电泳


1.  清洗玻璃板


一只手扣紧玻璃板,另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸馏水冲洗干净后立在筐里晾干。


2.  灌胶与上样


① 玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。(操作时要使两玻璃对齐,以免漏胶。)

     

来源:生物学霸


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