背景
在人类基因组中，大多数RNA没有蛋白编码能力，被称为非编码RNA。环状RNA是一种非编码RNA，它包括主要存在于细胞质中的外显子环状RNA（circRNA），和主要存在于细胞核中的内含子环状RNA（ciRNA）。虽然已有研究发现ciRNA可以促进基因转录，circRNA可以起到miRNA海绵的作用，但是环状RNA的大部分生物学功能仍然是未知的。
circ-Foxo3和Foxo3 mRNA 均由基因Foxo3编码，前期研究发现Foxo3的上调与细胞衰老减缓有关，可能是细胞周期进程受到影响，作者发现环状RNA circ-Foxo3在非肿瘤细胞中高度表达且与细胞周期进程相关。在这篇文章中作者发现沉默內源circ-Foxo3可以促进细胞增殖，circ-Foxo3的异常表达通过结合细胞周期依赖蛋白激酶2（CDk2）和周期依赖性激酶抑制剂1（p21）形成三元复合体，从而抑制细胞周期进程。CDK2通常与细胞周期蛋白A和E互作促进细胞周期进程，但是P21可以抑制这种互作并阻止细胞周期的进程。这种circ-Foxo3-P21-CDK2三元复合物的形成阻止了CDK2的功能且阻断了细胞周期的进程。
结果
1.circ-Foxo3的表达抑制细胞周期进程
作者使用qPCR检测了多种circ-RNA的表达量，结果显示circ-Foxo3在非肿瘤细胞（MEF，MCF和NIH3T3）内的表达量显著高于肿瘤细胞（67NR, 66C14, 4T07, 4T1 和B16）内的表达量（A），随后作者检测了在生长过程中不同融汇阶段的肿瘤细胞（4T07,4T1）和非肿瘤细胞（NIH3T3，MEF）中的细胞周期分布和circ-Foxo3的水平。（细胞的融汇程度是指细胞的密度或铺满度，同时也能够反映细胞的生长状态。如果融汇程度过高，由于空间、营养物质的限制，细胞的生长分裂都会受到抑制。）发现培养过程中circ-Foxo3的水平逐渐上升、细胞更多的集中在G1期（B和C）。
如果在培养基中添加EGF（表皮生长因子），circ-Foxo3的水平逐渐下降，而如果在培养基中添加EGF抑制剂AG1478，circ-Foxo3的水平逐渐上升（D）。为了证实circ-Foxo3在细胞周期中的作用，作者用靶向circ-Foxo3的siRNA来沉默circ-Foxo3（E），发现沉默circ-Foxo3后细胞有更强的增殖能力（F，G）、细胞更多的集中于S期和G2期（H）。
为了进一步研究细胞周期进程和环状RNA表达水平的关系，作者检测了NIH3T3细胞培养过程中的circ-Foxo3的表达水平和细胞所处的周期阶段，结果显示，G1期的细胞比例和circ-Foxo3的表达量之间具有很强的相关性（A和B）。
用circ-Foxo3表达载体及其他表达质粒转染NIH3T3细胞（C），发现circ-Foxo3过表达会导致细胞的增殖能力下降，同时位于G1期的细胞比例增加（G）。
2.寻找与circ-Foxo3互作蛋白，发现circ-Foxo3，P21和CDK2三元复合体
作者进一步探究circ-Foxo3是如何参与调控细胞周期进程的。首先使用细胞周期相关蛋白（如cyclin A、CDK2、CDK4、p16等）的抗体与NIH3T3细胞进行免疫沉淀，通过检测沉淀下来的circ-Foxo3和Foxo3的量，研究细胞周期相关蛋白与circRNA的潜在互作关系。结果发现，使用CDK2，CDK6，P16，P21和P27抗体进行免疫沉淀，能够富集circ-Foxo3，其中CDK2和P21抗体免疫沉淀富集circ-Foxo3最为显著，而线性Foxo3并未被富集。后期细胞实验发现，能被CDK2、p21抗体大量沉淀下来circ-Foxo3的细胞主要处于G1期。这也说明circ-Foxo3能阻止细胞周期进程，使细胞停滞在G1期。作者同样对转染了空载和circ-Foxo3的细胞裂解液进行免疫沉淀，转染了circ-Foxo3细胞的免疫沉淀复合体中circ-Foxo3显著富集，而并未在CDK2和P21免疫沉淀复合物中发现其他环状RNA，证明这是一种特异性的结合。表明CDK2和P21在circ-Foxo3的细胞周期调控过程中的起到重要作用。
3. circ-Foxo3通过与CDK2、p21形成三聚体来抑制细胞周期进程
作者接着进一步确认circ-Foxo3与CDK2和p21之间的互作，IP实验发现在转染了circ-Foxo3的NIH3T3 细胞中，CDK2的抗体免疫沉淀获得更多的P21（A），且周期蛋白A、E的抗体沉淀出更少的CDK2（B），（而circ-Foxo3的过表达并不会影响周期蛋白A、 E的表达（C）），
由于已经证实circ-Foxo3可以使细胞停滞在G1期，所以作者推测由circ-Foxo3介导的P21和CDK2之间的互作就发生于G1期，研究结果显示，只有在处于G1期的细胞中，P21的抗体可以IP获得更高水平的CDK2，CDK2的抗体也可以IP出更高的水平的P21（F）。以上这些结果表明circ-Foxo3，P21和CDK2之间形成了三元复合体。作者用梯度凝胶电泳实验，验证了三者的结合关系。（G）
4. 三元复合体的紊乱促进了细胞周期的进程
为了验证circ-Foxo3在介导P21和CDK2相互作用中的影响，作者用靶向circ-Foxo3的siRNA的载体转染NIH3T3细胞，发现circ-Foxo3的敲低并不会影响P21和CDK2以及周期蛋白A、E的表达（A），但是会降低CDK2与P21的结合（B），另一方面也恢复CDK2结合周期蛋白A、E的能力（C）说明，在circ-Foxo3缺失的情况下，CDK2恢复了与周期蛋白A、E结合作用。
作者也验证了circ-Foxo3对三元复合体形成的影响，发现在对照细胞中，一部分P21与circ-Foxo3、CDK2形成三元复合体，另一部分以单体形式存在，但是circ-Foxo3敲低后，P21只以单体形成存在了，CDK2也表现出类似的情况（F）。作者进一步检测沉默P21和CDK2后是否会影响circ-Foxo3与这些蛋白的互作。结果显示沉默P21后，P21抗体沉淀下来的circ-Foxo3减少（G）而circ-Foxo3的总水平并未改变。这说明p21与circ-Foxo3互作。相似的，沉默CDK2后CDK2的抗体沉淀下来的circ-Foxo3也减少（K）。并且CDK2沉默后CDK2的抗体沉淀出的CDK2和P21均减少。以上实验说明circ-Foxo3、 p21、CDK2形成了一个三聚体。
者检测了circ-Foxo3的探针是否可以pull down P21和CDK2，用circ-Foxo3或者其类似物的载体转染NIH3T3细胞，发现相对于转染类似物载体的细胞中，探针pull down下的circ-Foxo3明显更多（A），以及CDK2和P21（B）。而敲低circ-Foxo3敲低导致了pull down下的CDK2和P21减少（D），敲低P21后，circ-Foxo3的探针pull down下极少量的P21，但是pull down下的CDK2含量没有影响（E），说明P21的降低并不会影响circ-Foxo3与CDK2的互作，除了三元复合体外，还存在circ-Foxo3与CDK2的复合体。类似的，敲低CDK2后，circ-Foxo3的探针pull down下的P21不变， CDK2的量大大减少（F），表明也存在circ-Foxo3与P21的复合体。
5. p21、CDK2的结合位点的保护机制验证
作者用circ-Foxo3与空载质粒转染细胞，获得裂解液，用不同浓度的RNAse A处理，之后用P21和CDK2的抗体进行western blot分析，发现低浓度的RNAse A处理不会影响三元复合体的降解（A和B），这表明circ-Foxo3上P21和CDK2的结合位点被保护以至于不被RNAse A降解。但是在高浓度的RNAse A下，这些RNA酶可以“摧毁”三元复合体，用不同融汇程度的细胞去验证，发现在融汇程度的时候，用低浓度RNAse A处理的转染细胞出现两个条带。说明了，该作用发生在细胞生长受阻或停滞的情况下。
总结
该文首先在肿瘤细胞和非肿瘤细胞中检测circ-Foxo3的表达，发现circ-Foxo3在非肿瘤细胞中高表达，同时对细胞周期的分析发现circ-Foxo3的表达越高，在G1期的细胞比例越多，所以circ-Foxo3与细胞周期相关（现象）。
随后通过circ-Foxo3的沉默和过表达进行功能验证，发现沉默circ-Foxo3促进了细胞增殖，而过表达circ-Foxo3阻断了细胞周期的进程（功能）。
最后通过大量的免疫共沉淀和pull down实验正反向证明circ-Foxo3通过与CDK2和P21形成三元复合体调控细胞周期的进程（机制）。
大量的关于circRNA的研究集中于通过富集miRNA来参与调控其功能，而这篇文章的研究表明circRNA还可以与蛋白结合调控其功能，拓宽了环状RNA的研究思路。
参考文献：
Du W W, Yang W, Liu E, et al. Foxo3 circular RNAretards cell cycle progression via forming ternary complexes with p21 andCDK2[J]. Nucleic Acids Research, 2016, 44(6):2846.
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