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蛋白互作哪家强?

科普医学前沿 2019-05-03 20:42:29


    

 

    蛋白互作的研究方法现在可谓是非常经典了,一般关于蛋白的文章都会研究下两蛋白有无相互作用,而且方法繁多,下面简要介绍下三种经典蛋白互作的研究方法(其他方法我也不会啊):

 

1.  GST-pull down


       GST pull down是另一项验证蛋白相互作用的经典实验,其基本原理是将靶蛋白-GST(Glutathione-S-transferase谷胱苷肽巯基转移酶)融合蛋白亲和固化在谷胱甘肽亲和树脂上,作为与目的蛋白亲和的支撑物,充当一种“诱饵蛋白”,目的蛋白溶液过柱,可从中捕获与之相互作用的“捕获蛋白”(目的蛋白),洗脱结合物后通过WB或者质谱进行检测和鉴定。


2. 免疫共沉淀

(Co-Immunoprecipitation,Co-IP)


       免疫共沉淀是另一种研究蛋白相互作用的经典方法。原理是如果蛋白A与蛋白B(直接或间接)结合,那么当我们用抗体去结合蛋白A的时候,蛋白B也能被拉下来;当然,反之亦然。首先在细胞裂解液中加入抗兴趣蛋白的抗体,孵育后再加入Protein A或G,抗兴趣蛋白的抗体可以与Protein A或G结合,若细胞中有正与兴趣蛋白结合的目的蛋白,就可以形成这样一种复合物:“目的蛋白—兴趣蛋白—抗兴趣蛋白抗体—Protein A/G”,然后变性、聚丙烯酰胺凝胶电泳,经过Western Blot检测目的蛋白。



 3. 酵母双杂交

(Yeast Two-Hybrid System,Y2H)


       酵母双杂交系统是当前广泛用于蛋白质相互作用组学研究的一种重要方法。其原理是DNA结合域BD与转录激活域AD在分离的时候不具有转录激活功能,而当两者结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。靶蛋白和诱饵蛋白分别与结合域BD与转录激活域AD连接。当靶蛋白和诱饵蛋白特异结合后,诱饵蛋白结合于报道基因的启动子,启动报道基因在酵母细胞内的表达,如果检测到报道基因的表达产物,则说明两者之间有相互作用,反之则两者之间没有相互作用。打个小比方,两蛋白A、B有互作,相当于两块磁铁,分别连着火把和炸弹(DNA结合域BD与转录激活域AD),磁铁因为相互吸引结合在一起,火把就能把炸弹点燃,我们就可以通过爆炸知道这两种蛋白有互作啦。


   以上是研究蛋白互作常用的三种方法,到底哪家强?其实每种方法都有利弊。Co-IP不能反应蛋白的直接作用,两种蛋白质的结合可能不是直接结合,而可能有第三者在中间起桥梁作用。pull down方法可以证明蛋白间的直接作用,但属于体外实验,不能完全证明体内的作用情况。而Y2H的结果也存在间接作用以及非特异性作用,常用来筛选。所以需要根据自己的实验目的,适合选择方法。


      

                 

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