田姗姗，陈聪，柏雪，翟贵金，张锴*
（天津医学表观遗传学协同创新中心，天津医科大学基础医学院，生物化学与分子生物学系，天津 300070）
摘要：定量蛋白质组学在当前生物医学研究中发挥着重要作用。体外化学衍生是一种非常有效的蛋白质相对定量方法，适用于多种样品分析。本文尝试发展了基于马来酸酐标记的蛋白质定量分析新方法。通过优化反应溶液、反应时间、反应物比例等实验条件，马来酸酐标记可以达到高效的标记效率与准确的定量结果。另外，借助于 “click”反应，可以进一步利用巯基试剂进行二次衍生。总之，本文不仅发展了基于马来酸酐标记的蛋白质定量分析新方法，而且实现了二次可控的蛋白质和多肽衍生技术，在多样品蛋白质组的定量分析方面具有潜力。
关键词：液相色谱-质谱联用，定量蛋白质组学，马来酸酐标记，化学衍生，点击化学
稳定同位素标记联合高分辨质谱是定量蛋白质组学的主要研究手段[1]。除体内标记外，通过体外化学衍生，引入同位素标签是一种非常有效的蛋白质相对定量方法，适用于细胞、组织、体液等多种样品分析[2]。近年来，基于氨基反应的蛋白质组学定量方法得到快速发展。目前，基于氨基反应的定量蛋白质组学方法中最具代表性的是二甲基化标记[3]、丙酰化标记[4]和琥珀酰化标记[5]。尽管如此，仍有一些更具潜力的标记试剂需要人们去挖掘并加以利用。
马来酸酐不仅具有与琥珀酸酐相近的氨基反应条件，它还具有特殊的化学活性以及多种形式且廉价的同位素试剂。基于以上特点，我们认为马来酸酐可以作为一种新型氨基标记试剂应用于定量蛋白质组学研究中。
1实验部分：
1.1 仪器与试剂：
AutoflexⅢ TOF/TOF MS (德国Bruker公司)，超高压液相色谱-四极杆/静电场轨道阱质谱仪（QE，美国Thermo-fisher公司），水、甲醇和乙腈（HPLC级，美国Thermo-fisher公司），稳定同位素马来酸酐（13C4H2O3）和稳定同位素巯基乙醇（C2D4OHSH）分别购自Cambridge Isotope Laboratories公司（美国）和C/D/N ISOTOPES公司（加拿大）。
1.2 色谱质谱条件
样品用10 uL HPLC buffer A（0.1%甲酸，体积分数，以下同）溶解，取5 uL注射到Nano-LC 系统（EASY-nLC 1000, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA）进行分离。色谱柱为C18柱（150-mm×50-um, 2 um C18, Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA），多肽样品经过高效液相色谱柱梯度分离（总时间50 min，5%~35% buffer B（0.1%甲酸；95%乙腈）40 min， 90% buffer B 10 min，流速200 nL/min）后，经过nano-ESI离子源进入Q-Exactive mass spectrometer (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) 进行分析。电喷雾电压设为1.8 kV，扫描方法采用data-dependent模式，一级MS扫描后进行20次MS/MS扫描，扫描范围为m/z = 350~1750，分辨率为70,000，二级higher-energy collision dissociation (HCD) 能量为27%。MS/MS分辨率为17,500。
1.3 样品前处理：
马来酸酐标记：将多肽溶于200 mM NaHCO3溶液中。称取适量马来酸酐并用一定体积的甲醇溶解（酸酐易水解，现用现配），按照肽段:马来酸酐 = 1:100（摩尔比）进行反应（最终反应体系中水相:有机相 =3:1）。将马来酸酐溶液少量多次滴入到肽段溶液中，振荡混匀，若pH<8，加2 M氢氧化钠溶液调节溶液pH 9~10，25℃振荡反应2 h。最后，将样品真空浓缩抽干备用，质谱分析前需Ziptip除盐。
巯基试剂二次标记马来酰化肽段：将马来酸酐标记的肽段除盐、真空浓缩抽干后溶于甲醇中，向肽段的甲醇溶液中加入一定体积的巯基乙醇，加入三乙胺作为催化剂，室温振荡反应过夜（12 h）。反应完成后，将样品真空浓缩抽干，质谱分析前需C18-Ziptip除盐。
2. 结果与讨论
2.1马来酸酐标记的条件优化
首先，我们以合成的多肽为模型，研究了马来酸酐对赖氨酸侧链氨基和多肽N端氨基的衍生化反应。借助于MALDI-TOF质谱的表征和评价，优化了反应溶液、反应物比例等实验条件。如图1所示，有机相（DMSO和CH3OH）作为溶剂要比水相作为溶剂时标记效率高。但是DMSO沸点较高（189℃）难挥发，影响后续的质谱分析，因此我们选择CH3OH作为马来酸酐的溶剂。
图1：不同溶剂条件下，肽段ARTKQTARK (1058.63 Da) 马来酰化标记产物的MALDI-TOF-MS谱图：（A）对照组（未标记）；（B）H2O；（C）NaHCO3；（D）DMSO；（E）CH3OH
Fig. 1: MALDI-TOF-MS of peptide ARTKQTARK (1058.63 Da) labeled with maleic anhydride in different solvents: (A) control experiment (no reaction); (B) H2O; (C) NaHCO3; (D) DMSO; (E) CH3OH.
2.2稳定同位素马来酸酐的定量标记
在条件优化后的基础上，我们对Hela细胞全蛋白进行马来酰化标记并用LC-MS/MS进行了定量分析，如图2所示。各肽段轻重同位素标记产物的丰度几乎相等，与理论值1:1一致，说明了定量结果的准确性。
图2：三种肽段轻重同位素标记产物的LC-MS图谱
Fig. 2:MS spectra of peptides labeled with light and heavy maleic anhy-dride. (A) MA-VYEGERPLTKMA with heavy (m/z, 698.33, 2+) and light (m/z, 694.32, 2+). (B) MA-FEELNMDLFRwith heavy (m/z = 708.32, 2+) and light (m/z = 706.31, 2+). (C) MA-DNHLLGTFDLTGIPPAPR with heavy (m/z = 1018.51, 2+) and light (m/z = 1016.51, 2+).
2.3基于巯基-烯点击化学反应的二次标记
巯基-烯反应是点击化学反应中一种常见的反应类型。马来酰化标记后，产物为羧基马来酰亚胺，其中的双键具有与巯基反应的活性，我们考虑进一步利用分子结构中的双键来进行二次衍生反应。我们用了三种不同的巯基试剂（半胱氨酸、β-巯基乙醇和丙硫醇）来探究二次标记的可行性。
3 结论
本文建立了基于马来酸酐标记的蛋白质组定量分析新方法。我们首先在肽段水平上对标记条件进行了优化，并利用马来酸酐轻、重同位素试剂标记结合蛋白质组学方法对Hela细胞全蛋白进行了定量分析。此外，我们采用三种不同的巯基试剂（半胱氨酸、β-巯基乙醇和丙硫醇）探索了基于巯基-烯“点击化学”反应的二次标记的可行性。实验结果表明，基于马来酸酐稳定同位素标记的定量方法准确可靠且具有较好的重现性。另外，基于巯基烯的二次标记为稳定同位素多步顺次标记蛋白提供了可能，具有应用潜力。
参考文献：
[1]Cravatt, B. F.; Simon, G. M.; Yates, J. R. Nature 2007, 450, 991-1000.
[2]Tao, W. A.; Wollscheid, B.; O'Brien, R.; Eng, J. K.; Li, X. J.; Bo-denmiller, B.; Watts, J. D.; Hood, L.; Aebersold, R. Nat Methods 2005, 2, 591-598.
[3] Frost, D. C.; Greer, T.; Li, L. J. Anal Chem 2015, 87, 1646-1654.
[4]Xiang, F.; Ye, H.; Chen, R. B.; Fu, Q.; Li, L. J. Anal Chem 2010, 82, 2817-2825.[5]Nair, D. P.; Podgórski, M.; Chatani, S.; Gong, T.; Xi, W.; Fenoli, C. R.; Bowman, C. N. Chemistry of Materials 2014, 26, 724-744.
Maleic Anhydride Labeling-based Approach for Quantitative Proteomics
Shanshan Tian, Cong Chen, Bai Xue, Zhai Guijin, Kai Zhang*
(Collaborative Innovation Center of Tianjin for Medical Epigenetics, Tianjin Key Laboratory of Medical Epigenetics, Key Laboratory of Immune Microenvironment and Disease (Ministry of Education), Department of Biochemistry and Molecu-lar Biology, Tianjin Medical University, Tianjin 300070)
Abstract:Herein we describe the development of a novel stable-isotope maleyl-labeling-based approach for protein quantification. In optimized condition, maleic anhydride could serve as a high-efficiency reagent for labeling amino groups of tryptic peptides. Accurate quantification was further achieved using the labeling method combined with mass spectrometry. Furthermore,‘click chemistry’was successfully applied to the second modification of maleylated peptides via thiol-Michael addition reaction. The method holds promising potential for the rapid second derivatization of labeled peptides, leading to controllable, successive stable-isotope labeling of peptides.
Keywords: high resolution mass spectrometry, quantitative proteomics,maleic anhydride labeling, chemical derivatization, click chemistry
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