福建水产设备联盟

植物DNA的分离提取和含量测定

生化之窗 2019-05-18 10:25:55

一、目

初步掌握提取和定量测定植物DNA的方法。

二、原

细胞破碎后,从核中释放出与组蛋白结合的DNADNP),在SDS的作用下蛋白质变性与DNA分离。利用DNA不溶于酚和氯仿溶液而溶于缓冲液(与SDS结合的蛋白质正相反)的性质,将蛋白质和DNA分层。再利用DNA不溶于>50%的乙醇溶液的性质沉淀DNADNA260nm处有最大吸收峰,可在紫外分光光度计上测定DNA的含量。

三、操作

1DNA的分离

取花椰菜5g,剪碎后置于研体中。加入0.05g SDS。再加1-2mL提取液(pH7.0的氯化钠-柠檬酸缓冲液)研磨成匀浆后转入离心管中,再用提取液洗涤研钵多次,使最终加入提取液的量为10mL。而后向离心管中加入10mL氯仿-异戊醇,加盖,剧烈振荡30秒钟,4000r/min离心5分钟。吸取上清液在量筒中量其体积(注:标准方法是用酚+氯仿3次抽提。因酚毒性太,此处简化)。然后放入小烧杯中,沿烧杯壁缓慢加入约1.5倍体积预冷的95%乙醇。边加边用玻璃棒沿同一方向轻轻搅动,可见玻璃棒上有乳白色纤维状,即为DNA沉淀。

2DNA的定量测定

将玻璃棒上的沉淀物溶于pH7.0的氯化钠-柠檬酸缓冲液中,定容5mL。在260nm下比色,记下OD值。计算所测定溶液的DNA浓度。

计算公式:DNA浓度(μg/mL= 50*OD260

四、注意事项

1.离心机的使用:配平、放好内盖、离心结束取出离心管时不能晃动。

2.分光光度计的使用:开机预热、调波长、比色皿的使用、对照设置、仪器调零、调100、仪器不用时切断光路(多数是打开比色槽的盖子)。