做膜体系酵母双杂的筒子们看过来啦~~~还记得吗?小编上次讲解了根据蛋白质不同结构,需要选用不同的AD/BD载体,以便于与互作蛋白相连的泛素NubG和Cub-LexA-VP16可以相互作用,从而被泛素特异性蛋白酶(UBPs)识别、切割、启动报告基因表达,进而筛选相互作用因子。如果不记得了… …通过下面的表格回顾起来吧↓。
N端位置 | C端位置 | 合适的诱饵载体 | 备注 |
胞质 | 胞外/细胞器腔 | pBT3-N | …… |
胞质 | 胞质 | pBT3-N/ pBT3-STE | …… |
胞外/细胞器腔 | 胞质 | pBT3-SUC | N端有信号肽 |
胞外/细胞器腔 | 胞质 | pBT3-STE | N端无信号肽 |
那么问题来了,虽然知道什么情况选择何种载体了,然而我的蛋白质结构到底是怎么样的呢?N端、C端到底在哪儿?以及N端有无信号肽呢?
这个时候就需要我们通过蛋白质的氨基酸序列来预测蛋白结构了。下面,小编就来介绍几个常用的蛋白预测网站。为了方便说明,我们以一个已报道过的耐盐蛋白(TaSC GenBank:AY956330.1)为例进行介绍。
首先,找到目的基因的ORF区,翻译为氨基酸序列。如果是已登录的基因,可以直接在NCBI上下载。下面是该基因的氨基酸序列↓
MENLAMLWGIIGPGVAGALFGAGWWFWVDAVVCSAVQVSFIHYLPGIFASLAALMFNCVDKDAIGNDYYSSYGDDSEWRVKLWLFVAYVVSFVCLAGSVGLLVQDALTDKGPSVWTGVAGVLQCVFVLISGLTYWTCHTED
打开在线软件TMHMM网址,输入目的序列:
http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/
网页截图如下↓
然后,点击提交,等待预测结果,该蛋白预测结果如图所示,N端和C端均在膜内,有四个跨膜区。
感觉是不是so easy,下面再介绍第二个在线蛋白预测软件Phobius。同样的,分两步走,首先找到目的蛋白的氨基酸序列,然后输入、提交、分析预测结果即可。下面是TaSC在Phobius中的预测结果,该网站预测结果中还包含蛋白是否含有信号肽,TaSC不含信号肽,而蛋白拓扑结构预测结果与TMHMM预测一致。
http://www.ebi.ac.uk/Tools/pfa/phobius/
另外,小编再附送一个专门用来预测信号肽的在线预测软件,感兴趣的同志可以去进行尝试噢~~~~
综合不同网站分析结果,再根据前面载体选择条件就可以选择相应的载体了~~~~~对了,本例中的TaSC可以选择载体pBT3-N。
http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/
做酵母双杂,选欧易生物~~
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