看得见的蛋白互作新技术Duolink PLA

2023-05-10 14:56:27

导读


现今，科技发展的齿轮正在高速运转，每隔2-3年就会出现一个重大的技术变革引领生命科学走向更精细、更微观、更真实的水平，这其中也包括蛋白的研究。在疾病的致病机理、分子机制、信号通路、药物筛选以及新型诊断标志物的发现中，传统的蛋白研究“金标准”方法如Co-IP、Western blot、ELISA、IF等已呈现出很大的局限性。


你可能在实验中遇到过以下问题：

  • WB方法灵敏度较低，无法检测低丰度、瞬时表达的蛋白；

  • Co-IP方法无法检测蛋白之间的微弱相互作用及间接相互作用；

  • 蛋白过表达或融合标签后会改变其原有的功能，造成假阳性等结果；

  • 非内源性表达，无法反应真实的状态，结果无说服力；

……

看得见的蛋白互作新技术Duolink® PLA®加速了蛋白研究新发现。至今已在肿瘤学、神经生物学、免疫学、病毒学、表观遗传学、生殖发育、组织病理学、心血管、代谢等研究领域进行了广泛报道。下面针对不同方面的应用实例进行简单分享。

应用1：蛋白瞬时相互作用检测

上图是一篇肿瘤血管生成的研究,显示VEGF刺激前后的不同时间,Duolink PLA技术能够原位检测内皮细胞中VE-PTP与VEGFR2复合物的相互作用,每一个红点代表一个相互作用的复合物,蓝色代表细胞核。


应用2：微量细胞中的微弱蛋白互作检测

上图显示原代大鼠胚胎海马神经元使用雌二醇培养48h,PLA检测雌激素受体ERs/DYX1C1在神经突触中的相互作用(A,D为雌二醇(E2)刺激组,B,E 为未刺激组,C,F为无抗体阴性对照),每一个红点代表 ERs/DYX1C1相互作用的复合物,蓝色代表 Hoechst 染细胞核,绿色代表Actin蛋白。通过PLA技术,对DYX1C1的功能有新的理解,发现了神经元迁移、阅读障碍与雌性激素信号通路的联系,从而影响脑发育,调节认知功能。


应用3：病理组织蛋白相互作用原位检测

上图显示与anti-BRAF治疗前的肿瘤相比,eIF4F复合物的形成比率在免疫应答的肿瘤中降低,在抗药性转移的肿瘤中复合物形成比率升高,图中每个棕色的点状信号代表一个相互作用复合体。因此eIF4F 能够作为先天和获得性抗性的指示器,也能作为抗肿瘤治疗的靶标,通过封闭eIF4E–eIF4G相互作用或靶向 eIF4A,能够抑制eIF4F复合物的形成,从而协同抑制BRAF(V600),消除肿瘤细胞。PLA技术作为病理组织学研究的第二代新技术,在蛋白相互作用研究中具有高分辨率及精确性,是传统IHC实验无法实现的,能够建立高质量的病样组织标本库。


应用4．检测蛋白相互作用与翻译后修饰

上图文章是将PLA技术与流式技术结合，通过蛋白之间的相互作用及翻译后修饰研究，为肿瘤提供新的预后标志物。PLA技术与FCM的结合能在单细胞水平为蛋白相互作用和翻译后修饰提供更为强大的方法，能够为恶性肿瘤的治疗提供预后靶标。


应用5．单细胞水平检测组蛋白修饰分析

上图将PLA技术与原位杂交（ISH）技术联合起来开发出新的ISH-PLA技术，可在石蜡切片的组织样本中，对特定类型单细胞中的特定基因位点的组蛋白修饰进行可视化研究。图中箭头表示在人颈动脉和脑组织中的组蛋白修饰的PLA信号。PLA技术可以很方便地适用于单细胞水平组蛋白修饰和多个基因位点的检测。


应用6．高通量蛋白互作检测

上图文章基于药物在信号通路中的效应开发了高通量的PLA筛选技术，通过前期鉴定的激酶抑制剂文库进行高通量筛选。PLA药物高通量的细胞内原位检测，能对抑制剂诱导的PDGF信号通路中蛋白相互作用进行准确定量，结果更真实，筛选效率更高。

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