文章分享|一篇蛋白-lncRNA-蛋白互作研究的文章

2023-05-10 14:56:27


【The FOXN3-NEAT1-SIN3A repressor complex promotes progression of hormonally responsive breast cancer (2017), J. Clin. Invest., doi: 10.1172/JCI94233,IF:12.574 


这项最新研究成果发现:lncRNA在FOXN3-NEAT1-SIN3A转录因子调控网络中起“桥梁”作用,从而促进乳腺癌的发展。研究者利用RNA免疫共沉淀和高通量测序的方法鉴定了一个雌激素诱导的lncRNA(NEAT1),NEAT1在转录因子FOXN3和SIN3A的相互作用中起到桥梁作用,这是一个经典的蛋白-lncRNA-蛋白的作用模式。


ChIP-Seq和深度测序还揭示FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物能抑制GATA3基因的表达,从而促进体外乳腺癌细胞的侵袭和EMT过程,在体内能促进乳腺癌细胞的扩散和转移。


有趣的是,他们还发现 FOXN3-NEAT1-SIN3A复合物能反向抑制自身活性,在转录调控中形成一个负反馈环。


FOXN3-NEAT1-SIN3A与癌症的不良预后有关。下图是他们发现的NEAT1参与的ERα-NEAT1-FOXN3/NEAT1/SIN3A-GATA3轴在雌激素依赖型乳腺癌中的作用。

注:ERα:estrogen receptor-α 


这篇文章的研究思路和代表性图片如下:


一、机制研究:这一部分是让这篇文章过10分的关键,那么机制部分讲的是一个什么故事呢,下面分步为大家解读。

1、通过亲和纯化和质谱分析发现乳腺癌细胞中转录因子FOXN3和SIN3A发生共表达。


2、通过免疫共沉淀、免疫印迹和快速蛋白液相色谱法发现FOXN3和SIN3A在ER阳性乳腺癌细胞中发生相互作用,在ER阴性乳腺癌中没有相互作用。


3、假设FOXN3和SIN3A之间要靠DNA或者RNA来促进相互作用,通过在免疫共沉淀实验中加入DNase和RNase A,发现在ER阳性乳腺癌细胞中加入DNase时FOXN3和SIN3A还发生相互作用,当加入RNase A时FOXN3和SIN3A不再发生相互作用,说明FOXN3和SIN3A的相互作用要在RNA分子存在的情况下才能发生。


4、通过RNA免疫共沉淀偶联高通量测序(RIP-Seq)的方法,利用CIMS和Piranha二次计算得到该RNA分子可能为lncRNA(NEAT1或MALAT1),随后lncRNA microarray的结果发现NEAT1在ER阳性乳腺癌细胞中的表达高于ER阴性乳腺癌细胞,而MALAT1在ER阳性和ER阴性乳腺癌中的表达量相差不大,说明在转录因子FOXN3和SIN3A的相互作用中起重要作用的是NEAT1,而不是MALAT1。


5、qPCR显示雌激素(E2)能促进NEAT1的表达,正好解释了上述lncRNA microarray发现的NEAT1在ER阳性乳腺癌细胞中的表达高于ER阴性乳腺癌细胞。


6、通过CHART-Seq技术找到FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物的转录靶点,通过qChIP和RIP-qPCR发现 FOXN3和SIN3A能调控GATA3,TJP1,NCOA2和TLE1的表达,这些基因与癌症的EMT和侵袭相关。


7、RNA结合位点(RBRs)预测发现NEAT1结合到SIN3A的SAP18上。


8、通过ChIP-Seq和CHART-Seq 分析发现ERα是FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物的转录靶点,从而得到ERα-NEAT1-FOXN3/NEAT1/SIN3A-GATA3的负反馈环。


关于机制的故事就此讲完,下面在通过体内外功能研究,临床样本和生物信息学分析验证上述所讲的故事是否真实。


二、通过体内外功能实验验证FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物的功能。

FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物的体内外功能研究,包括EMT相关蛋白的检测,transwell侵袭,肿瘤动物模型中癌细胞的肺转移检测等。


三、临床样本和生物信息学分析。

通过癌症病人肿瘤组织的免疫组化和公共数据库的Kaplan-Meier存活分析研究FOXN3-NEAT1-SIN3A 复合物与癌症等级及不良预后的关系。


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