真核细胞中蛋白质量控制机制研究新成果 ——核酸交换因子Fes1、HspBP1如何改变错误折叠蛋白的“命运”

分子伴侣在蛋白质量控制上起着非常核心的作用，可通过与暴露的疏水氨基酸链结合来阻止未折叠和错误折叠的蛋白出现聚集和降解，并促进这些蛋白形成正确的折叠。一般来说，核酸的结合和水解所形成的结构变化控制着分子伴侣对底物的亲和力，并产生瞬时调控的底物结合反应，这一机制对蛋白进入折叠和降解等下游调控有着非常重要的影响。

 

在Hsp70分子伴侣蛋白上，N端的核酸结合域（N-terminal nucleotide-bindingdomain, NBD）控制着C端底物结合域（Substrate-bindingdomain, SBD）的构象。SBD由一个带有底物结合凹陷的β折叠结构域（SBDβ）和一个覆盖结合底物并阻止其在未成熟前被释放的α螺旋结构域（SBDα）。已知多肽底物结合到Hsp70蛋白是一个高度协同的过程：多肽底物结合到处于打开状态的Hsp70-ATP的SBDβ上后，底物自身和J-domain蛋白家族的辅分子伴侣（Co-chaperone）协同刺激ATP水解，引起SBDα盖子出现变构，进而完成底物的捕获。核酸交换可使ADP替换为ATP终止上述反应，从而引发SBDα帽子结构发生变化，使底物释放。在细胞中，核酸交换的发生可被结构不同核酸交换因子（Nucleotide-exchange factor, NEF）所促进。作为NEF，酵母Fes1蛋白或其人同源蛋白HspBP1，在其Armadillo结构域都具有凹陷的表面，可与Hsp70上NBD的Lobe II部分相互结合。胞质内缺少Fes1的酵母细胞将会使错误折叠蛋白无法有效地从Hsp70蛋白上释放，从而使错误折叠的蛋白无法被具有质量控制功能的泛素连接酶所识别。错误折叠的蛋白持续与Hsp70蛋白结合，会触发强烈的与热应激反应（Heat-stock response,HSR）相关的转录激活。因而，Fes1是调控错误折叠蛋白从Hsp70上释放这一细胞内蛋白质稳态系统（Proteostasis system）中的重要成员之一。

 

尽管已知NEF-Hsp70复合物存在显著不同的表型和结构特征，但Hsp70 NEF产生其特定功能的分子机制尚不清楚。对于Fes1，在使错误折叠蛋白从Hsp70上释放过程中，核酸交换活性被证实是必要但不充分条件因素，这表明在此过程中还有其它尚未被充分了解的因素在扮演着重要的功能角色。

 

对此，NaveenK. C.及其研究团队近日在《自然》杂志旗下的子刊《Nature Structural &Molecular Biology》上发表了其最新研究成果，在理论上解释了核酸交换因子Fes1和HspBP1如何调控错误折叠蛋白从分子伴侣上释放，并进一步被纳入形成正确折叠通路或降解通路。

 

在此研究中，作者发现Fes1和HspBP1都具有对其细胞功能有重要影响的N端释放结构区（Release domain, RD）。RD区可模拟多肽底物和Hsp70蛋白相结合，并与错误折叠蛋白相互竞争，进而使错误折叠蛋白从Hsp70蛋白上释放。Fes1蛋白具有长为38个氨基酸的延伸区，并通过4个连续的甘氨酸残基与Armadillo结构域的第一个α螺旋相连。对真菌Fes1同源蛋白的序列比对显示，其N端延伸区具有较低的保守性，仅两处短肽段有显著的不同——残基3-9和28-34。这两处保守区都在其N端为一个带有阳性电荷的残基，并在其后面接有疏水残基，这与Hsp70底物识别基序很相似。经LIMBO算法分析，也预测残基2-8与Hsp70底物有较高的结合可能性。这提升了Fes1利用其N端延伸区竞争底物并让底物从Hsp70 SBDβ上释放，成为灵活的RD的可能性。

 

为验证这一推断，作者对Fes1和酵母Hsp70 Ssa1之间形成的复合物进行了结构模拟，发现随着核酸交换的发生，Fes1可在SBDα构象变化后立即与SBDβ产生结合。限制性蛋白水解实验表明：胰蛋白酶可消化RD部分，但Armadillo结构域保持稳定。圆二色谱检测结果显示去除RD不影响Fes1的结构稳定性和其α螺旋部分。Fes1蛋白和N端2-34残基缺失的Fes1蛋白具有近似相同的融化温度（55±4°C和54±3 °C）。因而，酵母蛋白Fes1展示出与其人同源蛋白HspBP1上所报道过的一致的结构特征。上述结构分析数据支持“Armadillo结构域为紧密的折叠结构；RD区是个灵活的延伸区，是在核酸交换发生后与开放状态的SBD立即结合的适宜位点”这一观点。

 

通过突变分析，作者对RD区是否对Fes1的功能有重要影响进行了研究。敲除RD端第2-34个密码子、将底物样基序特定位点突变为丙氨酸这几种突变型设计，都可在fes1基因敲除细胞内达到与野生型Fes1蛋白相近或更高的表达量，但所有突变型都无法完全弥补fes1基因缺失引起的温度敏感表型。这些生长表型数据反映出Fes1蛋白RD区受损会造成蛋白错误折叠相关的蛋白毒性，并使细胞出现生长缺陷。接下来，作者在错误折叠蛋白Ste6* C和Δ ssPrA上进行了Fes1和Hsp70依赖性蛋白酶降解实验分析，实验数据表明上述所有突变型在错误折叠蛋白的分子伴侣依赖性降解上都展现出严重的缺陷。这进一步表明RD区与多肽底物从Hsp70上释放并随后进行水解有关。此外，作者还发现RD区突变处理组在fes1基因敲除细胞中都表现出强烈的热应激反应。因而，上述突变设计实验数据让我们可以得出结论：RD区是Fes1发挥蛋白质量控制这一功能所必需的，这一功能与其保守的底物样基序有关。

 

已知RD区不是弥补fes1基因敲除所引起表型缺陷的充分条件，通过Armadillo结构域来结合Hsp70是实现其功能所必需的。作者对RD区功能是否可转加到与NEF结构上不相关的BAG结构域Snl1上进行了测试。BAG结构域含有3个α螺旋结构簇，它通过与Fes1完全不同的方式结合到Hsp70 NBD上，并促进核酸交换的发生。在fes1基因敲除细胞中，BAG单独表达与RD区+BAG融合表达获得了同等的表达水平。但在热敏感测试中，两者却有不同的表现型。BAG单独表达组不能抑制fes1基因缺失引起的热敏感生长缺陷，但RD区+BAG融合表达组却能够使fes1基因缺失细胞达到Fes1恢复表达处理下同等的生长水平。与此类似，RD区+BAG融合表达组可抑制fes1基因缺失造成的对错误折叠蛋白诱导生成精氨酸类似物L-刀豆氨酸所表现出的超敏反应，但BAG单独表达组不能。此外，RD区+BAG融合表达组可完全抑制热应激反应表现，但BAG单独表达组不能。因此，RD区是Fes1蛋白的功能活性模块，并可转加到其它结构不相关的NEF上。

 

作者推测RD区结合到Hsp70 SBDβ上可能是以底物类似物的方式进行的。首先，经实验证实RD区+GST融合蛋白确实可以和Hsp70 Ssa1结合形成复合物。其次，ATP洗脱出的与RD区+GST融合蛋白所特异结合的Ssa1的量和谷胱甘肽洗脱出的蛋白量相当。在平行实验中，Fes1蛋白或RD区缺失Fes1蛋白两者可与等量的Ssa1相结合，并都表现出ATP敏感性。这进一步支持了Armadillo结构域是Hsp70蛋白的主要反应结合域这一观点。

 

Ssa1 SBDβ上的E423为具有感光激活能力的氨基酸p-benzoyl-l-phenylalanine（pBPa）,其在大肠杆菌上的同源位点Q424已被证实对大肠杆菌DnaK蛋白的底物结合有重要影响。APPY已被证实是Hsp70的底物，APPY和GST融合蛋白可特异性的交联到Ssa1_E423BPa-HA上，这表明pBPa与底物结合过程有关。在fes1缺失细胞中表达Ssa1_E423BPa-HA时，发现在Fes1恢复表达组和RD区缺失Fes1恢复表达组中都出现大量的缓慢迁移和紫外光依赖性交联产物。利用Fes1探针进行分析鉴定，数据表明在Ssa1上形成了交联产物，该交联产物的迁移比Hsp70蛋白要快，而且是依赖于RD区的。因此，认为在细胞中RD区与SBDβ底物结合凹陷部会产生结合。

 

Hsp70复合物上的MABA-ADP荧光核酸的释放动力学研究数据表明，RD区缺失未使HspBP1的NEF活性丧失，而核酸释放动力下降可能与缺少RD区的辅助结合有关。Fes1蛋白可有效地阻止底物结合到Ssa1，RD区缺失会使这一功能出现严重的缺陷。RD区发挥其功能伴随出现在Armadillo结构域刺激核酸交换发生的过程中，或是在这一过程之后。因而，认为RD区通过与SBDβ结合的方式来阻断Hsp70与底物结合。

 

RD区具有模拟Hsp70与多肽底物形成结合的功能，这解释了为何其他Armadillo型NEF带有无结构的N端延伸区。当对比人HspBP1的N端结构域（N-terminal domain， NTD），未发现其与Fes1 RD区明显相似的序列，但在功能上它们仍具有保守型，而它们之间对结构上要求较低。与这一观点相符，通过LIMBO算法预测，HspBP1上的46-54残基为Hsp70结合基序。将HspBP1的NTD序列连接到酵母蛋白上，可以完全的弥补fes1基因缺失引起的表现型缺陷、错误折叠蛋白Ste6*C的降解、以及热应激反应的抑制。因此，HspBP1 NTD序列可以替代Fes1 RD区，两者具有等同的功能，这表明Armadillo型NEF所延伸的NTD序列具有与Fes1 RD区同样的功能。

 

这一研究成果为解释Hsp70 NEF如何实现其特定功能在分子水平上提供了理论支持，并为更好地理解包括Marinescu-Sjogren综合症在内的蛋白质稳态系统混乱引发的相关疾病提供了新的启示。

来源：https://doi.org/10.1038/s41594-017-0008-2