新稿速递超声波处理蛋白质-磷脂复合物结构与功能性构效关系解析-福建水产设备联盟

摘要：大豆分离蛋白(SPI)和大豆卵磷脂(LEC)在中性条件下(pH 7.0)复合后，可自发组成蛋白质-磷脂复合物，但仍有部分未自组装的蛋白质和磷脂存在于溶液中。目前研究中仍实现不了蛋白质-磷脂最大复合程度以及最多结合位点的目标。同时，超声波对复合物性质的影响规律也尚不清晰。因此，该研究采用“超声改性-结构变化-功能表达”的研究理念，以大豆蛋白-磷脂为研究对象，采用荧光光谱法研究了不同超声波处理对蛋白质-磷脂复合程度的影响，采用起泡性及泡沫稳定性测定、表面疏水性分析、动态光散射粒度分析、浊度测定等重点解析了超声波对蛋白质-磷脂结构变化与功能性质表达的构效关系。结果表明：当超声时间较短时(12 min)，中功率(300 W)超声波对大豆蛋白-磷脂复合的影响最大，此时复合物的内源荧光性降低，表面疏水性升高。当超声时间较长时(24 min)，低功率(150 W)超声波会明显增加聚合物的起泡性及泡沫稳定性，同时粒径由未超声时的16.80 μm减小至6.39 μm、浊度明显降低且溶液分散均匀、性质稳定。但随着超声功率的进一步增大，蛋白质发生不溶性聚集，导致其与磷脂间的相互作用变弱。

关键词：大豆蛋白-磷脂；超声波处理；表面疏水性；粒度分析；荧光光谱

大豆蛋白作为一种营养价值较高的植物蛋白被广泛地应用在食品加工与制造中[1]。但天然大豆蛋白的功能性质在加工中会受到一定程度的破坏，尤其是当溶液的pH接近蛋白质的等电点时，蛋白质的各种性质都会大幅度下降，因此常对蛋白进行适当的改性[2]。在过去几年中，蛋白质的改性技术研究主要集中在物理改性和化学改性[3-4]。近年来，大豆蛋白天然改性成为研究热点。如引入生物小分子使其与蛋白质发生相互作用，复合体系的产生对大豆蛋白的功能性质具有重要的影响。

大豆卵磷脂是食品中重要的营养成分，具有改善食品风味和质地的作用。作为一种两性离子表面活性剂，它可以通过结合的方式使蛋白质的表面活性发生改变，且他们之间的交互作用会影响大豆蛋白的功能性质。现今文献已对大豆蛋白-磷脂交互作用方式进行了部分研究，但未能清晰地解释超声波处理等物理加工方式对蛋白质-磷脂交互作用的影响，更缺少复合物结构及功能性质随超声波强度和超声波时间变化规律的研究。BECKWITH等[5-6]通过研究预测大豆蛋白与卵磷脂之间存在交互作用，且蛋白质和磷脂间的交互作用可以使蛋白质包裹到磷脂的囊泡或胶束中。磷脂与蛋白会通过静电作用和疏水作用结合形成复合物[7]。环境因素可以改变复合体系的性质，如：pH可以修改蛋白质和磷脂复合物的表面活性，同时改变液滴之间的流体动力学作用；NaCl浓度的增加导致乳清蛋白-磷脂乳液粒径增大，易造成油滴聚集降低乳液稳定性[8-9]。但是物理改性技术如：超声波处理对蛋白质-磷脂复合程度及复合物性质的影响研究目前仍缺少规律性，并未清晰阐明超声波处理对蛋白质-磷脂交互作用的影响。

因此，本文中重点研究超声功率和超声时间对大豆蛋白-磷脂复合程度及复合物功能性质的影响。采用低、中、高3种超声功率(150、300、450 W)和短时、长时2种超声时间(12、24 min)对大豆蛋白-磷脂复合物进行超声处理，并对复合物的结构性质、理化特性及功能特性进行了分析。综合实验结果，总结出不同超声处理条件对大豆蛋白-磷脂复合物形成的影响，为超声技术运用于大豆蛋白-磷脂复合产品、其他蛋白与磷脂复合的食品加工过程提供了理论依据。

1 材料与方法

大豆，北大荒绿野食品有限公司；大豆分离蛋白，实验室自制；大豆卵磷脂，Sigma公司；1-苯胺基-8-萘磺酸(ANS)，Sigma公司；HCl、NaOH，北京新光化工试剂厂；NaH2PO4、Na2HPO4,天津市东丽区天大化学试剂厂；正己烷,天津北科化学品有限责任公司；国产分析纯试剂。

超声波细胞破碎仪，宁波新芝生物科技股份有限公司；AL204型分析天平，梅勒特-托利多仪器(上海)有限公司；pHSJ-4A型实验室pH计，中国上海雷磁公司；GL-20G-II高速冷冻离心机，上海安亭科学仪器厂；722型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；F-4500荧光分光光度计，日本HITACHI公司；Mastersizer 2000 激光粒度仪，英国马尔文仪器有限公司；ULTRA-TURRAX UTL2000 乳化机，德国IKA仪器设备公司。

1.3.1 大豆分离蛋白制备

大豆分离蛋白的制备参考WOLF [10]等人的方法，并适当修改。称取无虫害、新鲜大豆磨粉并过60目筛，所得豆粉与正己烷以1∶3的比例混合，在40 ℃下搅拌2 h脱脂3次。将脱脂豆粉按1∶10的比例与水混合，然后用2 mol/L的NaOH调节溶液的pH至8.5，45 ℃搅拌2 h后，将其悬浮液在4 ℃条件下10 000×g离心20 min，取上清液再用2 mol/L HCl调节pH值至4.5。静置后在4℃条件下6 000×g离心20 min，得蛋白沉淀水洗2次，最后用2 mol/L NaOH调节蛋白质pH值至7.0。将此蛋白溶液冷冻干燥后研磨即得粉末状大豆分离蛋白。

1.3.2 大豆蛋白-磷脂复合物的超声制备

将大豆卵磷脂与大豆蛋白以1∶10的比例混合于50 mL锥形瓶中，大豆蛋白浓度为10 mg/mL，室温下不断搅拌2 h。然后将锥形瓶置于冰水浴中1 h使混合液温度低于2 ℃，超声处理的方法及条件设定参考HU等人[11]并进行一定的修改。将超声波处理器的钛探头(直径0.636 cm)插入液面下，距离锥形瓶底部1 cm处，在20 kHz下分别在输出功率为150 W, 300 W, 450 W下处理12 min和24 min，超声时间4 s，间隔时间2 s，并每5 min向冰水浴中加入冰块保持低温，将未超声处理与不同超声处理下的大豆蛋白-磷脂复合物按照表1所示编号为样品0～6号。

1.3.3 起泡性及泡沫稳定性

复合物水溶液起泡性及泡沫稳定性的测定方法参考SATHE等人[12]的方法。不同超声处理的大豆蛋白-磷脂水溶液各100 mL，用高速均质机均质40 s，连续均质3次共2 min，转速17 500 r/min。起泡性(FC)与泡沫稳定性(FS)计算公式如下：

其中：V0为均质后液面的高度，V30为静置30 min后再次记录的液面高度。

1.3.4 表面疏水性测定

蛋白质-磷脂复合物的表面疏水性测定参考KATO和NAKAI[13]的测定方法，将不同超声处理的大豆分离蛋白与大豆磷脂溶液以10 000×g离心30 min，取上清液测定蛋白浓度，用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液依次将蛋白样品稀释，保证浓度在0.05～0.4 mg/mL。实验中激发波长λex=390 nm，发射波长λem=468 nm，夹缝为5 nm，扫描速度10 nm/s。取溶液4 mL，分别加入40 μL用0.01 mol/L的磷酸盐缓冲液(pH 7.0)配制的最终浓度为8 mmol/L的ANS溶液，经振荡快速混合后静置3 min后测定样品荧光强度(FI)。以荧光强度与蛋白质浓度作图，表面疏水值为蛋白质分子的初始段斜率。

1.3.5 粒径的测定

利用Mastersizer 2000 激光粒度仪进行粒径分布测定。采用不同超声条件形成的大豆蛋白-磷脂复合物溶液样品进行测定，泵速1 800 r/min，颗粒折射率1.46，分散剂折射率1.33, 吸收参数0.001[14]。

1.3.6 浊度的测定

蛋白质-磷脂复合物溶液浊度的测定参考MARTINI等人[15]的方法，样品经超声处理后用722型可见分光光度计在600 nm下测定各蛋白溶液的吸光度。

1.3.7 荧光光谱的测定

蛋白质-磷脂复合物的内源性荧光光谱采用F-4500荧光分光光度计测定(色氨酸荧光光谱)。将超声制备好的蛋白质-磷脂复合物样品适度稀释后配置蛋白质浓度为0.15 mg/ mL。大豆分离蛋白内部的色氨酸基团为荧光探针分析荧光发散光谱，激发波长设定为290 nm，发散波长扫描范围为300～500 nm，激发狭缝为5 nm，同样发射狭缝宽也为5 nm。重复扫描3次[16]。

1.3.8 数据统计及分析

所有数据均重复实验3次，结果表示为平均数

±s)。数据统计分析采用SPSS 18.5软件对数据进行ANOVA差异显著性分析，P<0.05为显著性差异。绘图采用Origin 9.1软件。

2 结果与讨论

2.1 起泡及泡沫稳定性的分析

不同超声条件对大豆蛋白-磷脂复合物起泡性及泡沫稳定性的影响如图1所示。蛋白质-磷脂溶液受到高速搅拌时，大量气体进入溶液中形成一定量的水-空气界面，溶液表面张力降低后形成泡沫的能力即为复合体系的起泡性[17]。起泡性改变与蛋白结构和物理化学性质的变化有关。

图1 不同超声处理条件下大豆蛋白-磷脂复合物的起泡性及泡沫稳定性
Fig.1 Foaming capacity and forming stability of untreated and ultrasonication-treated soybean protein-lecithin complex

如图1 所示，未经处理的蛋白质-磷脂样品起泡性和泡沫稳定性都较差，经过超声处理后各样品的起泡性和泡沫稳定性均表现出一定程度的升高。在低功率超声处理时，长时间超声后起泡性及泡沫稳定性比短时间超声的好。然而，在中功率和高功率超声处理时，长时间超声处理后样品的起泡性和泡沫稳定性都较差。超声作用有助于将蛋白质解聚成小分子亚基，同时暴露蛋白质的疏水基团，增加了气水界面蛋白分子数目和与磷脂疏水结合的程度，从而不同程度提高了起泡能力[18]。但随着超声时间的延长以及超声功率的增大，大豆蛋白分子结构进一步打开，分子间重新形成更大的聚集体，表现界面膜的稳定性下降，起泡能力下降[19]。蛋白质-磷脂复合体系起泡性的变化与其结构变化密切相关。

2.2 蛋白浓度分析

样品表面疏水性测定之前，采用试剂盒测定离心后样品的蛋白质浓度。不同超声处理条件下样品的蛋白质浓度见图2。实验结果显示，不同超声处理后样品中蛋白质浓度分别有不同程度的提升。JAMBRAK等[11]研究指出超声作用会提升大豆分离蛋白的溶解度。当超声时间为12 min时，300 W超声功率条件下复合物中蛋白质的溶解度最高，低、高功率超声条件下蛋白质的溶解度接近于未超声的样品。当超声时间延长至24 min后，低功率超声波产生的空化作用足以使蛋白质结构完全展开，埋藏在内部的疏水基团和巯基暴露到分子表面，与磷脂通过疏水相互作用结合后复合物具有更多的亲水基团，因而溶解度提升。另一种可能是因为适宜强度的超声处理后，蛋白质分子质量降低，更多的蛋白质区域暴露到水分子周围，增加了溶解度。

图2 不同超声处理条件下复合物中大豆蛋白的浓度
Fig.2 Water solubility of untreated and ultrasonication-treated soybean protein-lecithin complex

2.3 表面疏水性分析

不同超声条件处理后复合物中大豆分离蛋白的表面疏水性如图3。表面疏水性(H0)是衡量分子表面疏水基团数目的指标[20]。磷脂与蛋白在超声作用下形成复合物会影响蛋白质的表面结构，增加非极性基团间的疏水作用。经过离心后，不可溶部分被离出，上清液中吸附于磷脂的蛋白均属于可溶性蛋白，因而可采用荧光探针法评价蛋白质-磷脂复合体系的表面疏水性，同时反应蛋白质的三级结构。

如图3所示，未处理的样品表面疏水性最低，这与HAYAKAWA等人[21]的研究结果一致，未经超声处理的大豆蛋白中大多数疏水基团被紧密包埋在球状区域内，蛋白质的疏水基团和荧光探针之间的接触受到抑制，疏水性较低。经过超声处理后，所有样品中蛋白质的表面疏水性都有所升高，且在低超声功率条件下(150 W)，长时间的超声处理使表面疏水性增强。这可能是由于大豆分离蛋白与磷脂相互作用后，改变了自身的空间结构，同时也以疏水相互作用的形式影响了磷脂分子的排列形式[22]，超声波作用使二者的结合更为紧密，蛋白质以疏水作用固定在磷脂膜上，所以复合物的表面疏水性进一步提高。但中(300 W)、高超声功率(450 W)条件下，长时间的超声处理反而会使表面疏水性减弱。这可能是由于大豆分离蛋白发生一定程度的聚集，这种蛋白质聚集阻止了疏水基团的暴露[23]。

图3 不同超声处理条件下复合物中大豆分离蛋白的表面疏水性
Fig.3 Surface hydrophobicity of untreated and ultrasonication-treated soybean protein-lecithin complex

不同超声处理对大豆蛋白-磷脂复合物粒度的影响见图4、图5。当超声波作用于复合物溶液时，液滴破碎与重新聚合现象同时发生，因此，溶液中粒径的变化情况可以通过体积平均径D[4,3]和粒径分布表示，同时表征蛋白质聚集、解聚等行为。如图4、图5所示，未超声时共聚物的体积平均径为16.872 μm，呈双峰分布，且主要分布在10～100 μm之间。经过超声处理后粒度降低，但当超声功率增加超过300 W后，粒径又增大，这说明高功率(450 W)超声作用下，可溶性蛋白质聚集体重新聚集成更大的不溶性聚集体，减弱了与磷脂间的相互作用[24]。也可能是由于超声作用会降低蛋白质-磷脂溶液的黏度，导致粒径增大。该结果与他人的研究结果类似，超声可以降低大豆分离蛋白的粒径，但高强度超声波对粒径的降低效果不明显[25-26]。在低功率(150 W)超声处理时，湍流和微流效应增加分子间的碰撞和聚集，在空化作用下形成微小液滴。尤其是延长超声时间至24 min后，变化更加明显。由图4中4号曲线可明显发现体系中小粒径含量升高，大粒径含量降低，双峰分布更窄，说明此时溶液更加稳定[27]。

图4 不同超声处理条件下大豆蛋白-磷脂复合物的粒度分布
Fig.4 Particle size distribution of untreated and ultrasonication-treated soybean protein-lecithin complex

图5 不同超声处理条件下大豆蛋白-磷脂复合物的粒径D [4,3]
Fig.5 Particle size D [4,3] of untreated and ultrasonication-treated soybean protein-lecithin complex

不同超声处理对大豆蛋白-磷脂复合物浊度的影响见图6。蛋白-磷脂复合物的浊度可以直观反映溶液中蛋白质-磷脂颗粒的分散状态，也可以间接反映溶液中蛋白质-磷脂的聚集状态以及粒径大小[28]。未经过超声处理的蛋白质-磷脂样品分散在缓冲液中形成的溶液较浑浊，这是因为溶液中聚集体的粒径较大，在光线的作用下，发生漫反射，使溶液浊度增大[29]。经过不同条件超声波处理后样品的浊度发生不同程度的降低，可能是因为超声波的空化作用产生巨大的压强，减小了蛋白质分子的粒径，所以浊度降低。超声波对蛋白质-磷脂复合物浊度的影响具有一定规律性，超声时间较短时，样品浊度先减小后增大，说明中等强度超声波可以将样品粒径降低到合适大小，漫散射降低后浊度减小；超声时间较长时，蛋白-磷脂复合物的浊度随着超声功率的增加而增大，说明增大超声功率会导致蛋白质分子发生再聚集，浊度随聚集体的增多而增大。

图6 不同超声处理条件下大豆蛋白-磷脂复合物的浊度
Fig.6 Turbidity of untreated and ultrasonication-treated soybean protein-lecithin complex

2.5 荧光光谱分析

不同超声处理后复合物中蛋白质的荧光光谱见图7。荧光光谱是一种能反应蛋白质三级结构构象变化灵敏且有效的方法[30]。图7表示不同超声条件处理后大豆蛋白-磷脂复合物的荧光发射光谱图。

图7 不同超声处理条件下复合物中大豆分离蛋白荧光光谱谱图
Fig.7 Emission fluorescence spectra for 0.15 mg/mL soybean protein of untreated and ultrasonication-treated soybean protein-lecithin complex

在本研究中，λmax均大于330 nm，说明Trp残基位于蛋白质分子外部的极性环境中[31]。0表示未经超声处理的样品荧光发射光谱的变化。当激发波长为280 nm，扫描为300～400 nm发射谱时，经过超声波处理后的样品荧光光谱形状无显著变化，但最大吸收峰的荧光强度值均低于未经超声处理的样品，且样品的λmax均发生红移，说明蛋白质在磷脂和超声波的共同作用下构象发生改变，Trp侧链转移到蛋白分子表面造成蛋白微环境极性的增加[32]。在所有超声条件中，低强度和中强度超声使荧光强度降低，这是由于该条件下蛋白质结构打开与磷脂发生相互作用后，使发色基团暴露到溶剂中，造成荧光强度的降低[33]。但是高强度超声波处理后蛋白质发生一定的聚集，形成不溶性的蛋白质，与磷脂间的相互作用减弱，发色基团包埋在蛋白质的聚集体中使荧光性又有一定程度的升高。

3 结论

本文采用超声处理探究超声功率和超声时间对大豆蛋白、磷脂相互作用及复合物功能性质的影响。本研究得出以下结论： (1) 适宜的超声波处理可以显著提高大豆蛋白与磷脂的复合程度，同时提升功能性质如：表面疏水性、起泡性及泡沫稳定性。(2)经过低、中功率超声波处理后蛋白质的荧光性和浊度降低，但高超声功率处理现象相反。可见超声时间较短时，中功率超声对大豆蛋白与磷脂的复合产生有利作用。(3) 延长超声时间后，复和物的粒径大小随着功率的增加而增大，表面疏水性下降。因此当超声时间较长时，较低的超声功率可将液滴分散均匀、维持稳定，并使起泡性及泡沫稳定性等功能性质达到最大，过高的功率不仅影响效果且会造成能量浪费。该结果为超声技术运用于大豆蛋白-磷脂复合产品、其他蛋白与磷脂复合的食品加工过程提供了一定的理论依据。

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Effect of ultrasound on soybean protein-phospholipid structure and function

BI Shuang, LI Yang, MAO Hui-ting, SUI Xiao-nan, WANG Zhong-jiang, QI Bao-kun, JIANG Lian-zhou*

(Northeast Agricultural University College of Food Science and technology, Harbin 150030, China)

ABSTRACT：Soy protein isolate and lecithin can make protein-lecithin complex spontaneously under neutral environmental condition (pH 7.0), but there are still protein and lecithin out of self-assembly in the solution. The large amount of lecithin and protein binding are still under study. At the same time, the effect of ultrasound on?the complex was unclear. Therefore, this study is based on the theory of “ultrasound modification-structure change-functional expression”, and using fluorescence spectrum to study different conditions of ultrasonic treatment on protein-lecithin compound, and discovered the relationship between protein-lecithin structure change and the functional properties of the complex through surface hydrophobicity analysis, dynamic light scattering particle size analysis, determination of turbidity, foaming ability and foam stability of the complex. The results showed that short ultrasonic time combined with medium ultrasonic power had the greatest influence on complex and the value of endogenous fluorescent was reduced. However, surface hydrophobicity was increased. When the ultrasonic time increased to 24 min, it could significantly increase functional properties of the complex, decrease particle size from 16.87 μm to 6.49 μm, and turbidity was also decreased which was beneficial to homogeneous distribution and stability of the solution. However, with continually increased the ultrasonic power, the insoluble protein aggregate occurred.

Key words：soybean protein-phospholipid; ultrasonic processing; surface hydrophobicity; particle size distribution; fluorescence spectrum

第一作者：硕士研究生(江连洲教授为通讯作者,E-mail：jlzname@163.com)。

基金项目：国家科技支撑计划课题(2014BAD22B00)；国家"863"计划(2013AA102104)；黑龙江省自然科学基金项目重点项目(ZD201302)；高等学校博士生学科点专项科研基金博导类资助课题(20132325110013)