激酶组的PRM靶向定量, 验证路上不摔跤

在众多的生物研究应用中，对蛋白质丰度的可靠量化是至关重要的。传统检测方式多基于免疫反应，但抗体的特异性和稳定性问题短时间内难以解决，目标蛋白的定量检测受到了很大限制。因此，研究人员积极探索基于质谱的靶向蛋白检测技术。PRM (parallel reaction monitoring)分析作为这类技术的佼佼者，可以在单次分析中实现几百个目标肽段的精确定量。但在PRM的实际应用中，技术体系的选择对于检测结果有着极大的影响，存在较高的技术壁垒。

近期，来自美国加州大学旧金山分校的研究团队提出了一种优化的技术体系，可以利用PRM技术同时对150个激酶进行定量检测。今天我们就来介绍PRM对激酶组的定量检测是如何进行的：

An optimized chromatographic strategy for multiplexing in parallel reaction monitoring mass spectrometry: Insights from quantitation of activated kinases

MOLECULAR & CELLULAR PROTEOMICS

IF=6.5

检测体系的稳定性和灵敏度对于PRM检测至关重要。因此，研究人员的第一项工作就是确定检测体系。他们首先利用小鼠骨髓细胞作为样品进行shotgun实验，筛选最合适的液相色谱柱，之后根据shotgun鉴定蛋白的GO功能注释结果，选择了属于细胞进程（cellular process）的蛋白作为目标，以这些蛋白的肽段鉴定信息为参考，进行靶向PRM检测，从而对质谱的参数进行优化。经过对液相色谱柱的性能、温度条件和质谱型号参数的多次比较筛选，最终他们选择了200-cm C18-硅胶整体柱，最适温度条件为40°C，使用的质谱仪为Q Exactive Plus (Thermo)。在这个技术体系中，靶向检测了293个蛋白的856个肽段。

首先，研究人员对人细胞样品的蛋白组进行shotgun分析。为了提高激酶检测的覆盖度，研究人员利用MIB（multidrug inhibitor beads）富集活性激酶，富集之后再根据shotgun的结果选择目标肽段，利用PRM进行靶向定量检测，最终在人细胞中靶向检测了182个激酶的929个目标肽段。

在建立了MIB-PRM的激酶检测体系后，研究人员接下来在实际的激酶调控研究中进行了验证。他们使用三种不同的MAP激酶抑制剂（GDC-0973、GDC-0623和SCH772984）处理了结直肠癌细胞系HCT116，并和DMSO处理的对照组进行比对。

研究人员首先用western blotting验证了不同抑制剂处理对激酶的影响：GDC-0973维持了MEK的磷酸化，抑制了下游激酶ESK和RSK的磷酸化。GDC-0623使MEK稳定在去磷酸化形式，并且抑制了ESK和RSK的磷酸化。SCH772984抑制了ESK的磷酸化，但引起了MEK的反馈激活。

接下来，研究人员用MIB-PRM的技术体系检测了不同处理的细胞系中激酶组的差异。在单次PRM 检测中，他们获得了150个激酶的800个目标肽段的定量分析结果。通过对激酶组的定量分析，揭示了MAPK信号被阻塞时，TGF-β家族受体会补偿激活作为响应。同时，这项研究也证明了PRM技术可以稳定、准确、高通量地完成激酶组定量检测。

通过BIM-PRM技术，研究人员成功实现了高通量的激酶组定量检测。与基于抗体的检测方式相比，PRM避开了抗体特异性带来的检测限制；与非靶向的质谱定量技术相比，PRM无需进行样品分级，即可排除蛋白丰度的影响，实现对于多个目标蛋白的定量检测。

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