听课笔记之蛋白质谱的原理及使用(一)

从10月底开始，由克里克学院与康昱盛主办的蛋白质组学网络大课堂正式开班了！整个课程由21堂大课组成。作为蛋白质组学纯小白一枚，小编也打算借这个机会好好学习感受一下。继第一讲“蛋白质组学研究方法概述”和第二讲“蛋白质谱实验样品前处理”之后，小编再接再厉，整理了第三讲“蛋白质谱的原理及使用”的听课笔记，分享给各位。

>>听课笔记之蛋白质组学研究方法概述（上）

>>听课笔记之蛋白质组学研究方法概述（下）

>>听课笔记之蛋白质组学样品前处理（一）

>>听课笔记之蛋白质组学样品前处理（二）

>>听课笔记之蛋白质组学样品前处理（三）

>>听课笔记之蛋白质组学样品前处理（四）

这次课程的授课老师是来自中国农业大学生物学院的李溱老师。李老师于1999年本科毕业于北京师范大学，2007年于美国德克萨斯州Texas A&M大学获得博士学位，2008年-2009年在University of Illinois at Urbana-Champaign从事博士后研究。于2011年加入中国农业大学生物学院，任副教授，在植物生理学与生物化学国家重点实验室及中国农业大学“985”功能基因组中心生物质谱实验室工作，负责生物质谱实验室日常运行，对外提供蛋白质组学和代谢组学技术服务，并开展基于高分辨质谱技术的植物代谢组学和蛋白质组学研究工作。李老师对各种质谱仪器的原理、特点及运行维护有着非常丰富的理论积累和实践经验，很有幸能邀请到他为我们介绍蛋白质谱的原理和操作。

（文中所有图片均来自李溱老师的讲义，并获得发表授权。）

本次课程的内容分三大部分：

• 质谱仪的原理、使用与维护

• 纳升型液相色谱仪的使用与维护

• 生物质谱运行状态的评估

接下来小编就跟大家详细分享一下这几部分的知识精华吧。今天要分享的第一部分内容是质谱仪的基本原理和种类。

为了直观一些，我们先上几张质谱仪的照片，大伙儿感受一下~

质谱仪到底是个啥呢？我们还是先来掉个书袋吧，“官方”定义是这样的：用来测定气态离子质荷比（m/z）的仪器。对照的英文是：An instrument used to determine the mass-to-charge ratio (m/z) of gas phase ions.

我们来抓抓这里面的关键词：气态、离子、质荷比！

从这几个关键词里，你感受到了吗？其实质谱仪检测的范围是非常有限的。首先，它只能检测气态的物质，其次，该物质还必须得是离子。而检测得到的数值也只是该离子的质量与电荷的比值！ 也就是说，当离子带一个正电荷或一个负电荷时，质谱仪检测到的m/z的数值就刚好等于离子的重量；当电荷数大于等于2时，我们得用检测到的m/z的数值乘以电荷数，才能得到离子的质量。

看到这里，你是不是有点感慨，原来大名鼎鼎的质谱仪，也就这点儿功能啊~小编要说的是，功能不在多，而在专！就是这点功能，却引领了整个领域的革新！

质谱仪的离子质荷比的测定，可以通过质谱图展示。那么质谱图又是长什么样的呢？

我们以上面两张质谱图为示例，质谱图的横轴就是质荷比，纵轴是离子强度。第一张是正丁烷的谱图，横轴质荷比的取值范围是从10-60。另一张是代谢物质谱图，横轴质荷比是100-400。那些小柱子就是信号峰了。

接下来，我们要聊的问题就是：质谱仪是如何获得这些质谱图？

前面说了，质谱只能检测离子，所以要得到质谱图，首先我们要获得离子。离子分为两类：正离子和负离子，那么对应的，它们带正电荷或者带负电荷。

要生成一个正离子，其实就是分子结合一个或多个质子，就可以带上正电荷，这是最简单直接的办法；或者呢，让一个分子失去一个电子，也可以带上一个正电荷。相应的，生成负离子的方法，就是分子结合一个电子，或者失去一个质子。

我们还是以正丁烷为例，它的分子量是58，我们在质谱图的横轴（m/z）58处正好看到一个峰，说明是正丁烷的质谱图是正丁烷分子失去一个电子后，生成正离子而得到的。

在负离子模式下是可以看到得到一个电子的分子的质谱图

我们再来看看另外一个例子，比如一个分子式为C₂₂H₂₅O₃N₃的化合物，通过计算知道它的分子量是379.1890，而在质谱图我们看到m/z轴上的峰是在380.1958，实际上是这个化合物得到一个质子后（分子量+1），形成正离子产生的质谱图。

所以呢，不同的质谱仪，不同的化合物，会得到不同的质谱图。比如第二个例子，如果你以为它的分子量就是380.1958，那计算出的结果肯定就是错的了。

那么，质谱仪是如何得到不同离子的质荷比信息呢？要回答这个问题，我们可以从质谱仪的种类和工作原理聊起。

前面说了，质谱仪是测定气态离子质荷比的仪器，所以进入质谱的离子一定得是带电的。当带电的离子进入电场或磁场时，它的飞行轨迹遵循一定的规律。比如我们把离子放到一个磁场当中，它飞行的时候会产生一个偏转，而偏转的半径与离子质荷比、磁场强度，以及它的动能有关，这就是洛伦兹力。通过检测它的偏转程度，就可以计算出它的质荷比。

所以最简单的质谱仪就是这种磁质谱仪，让离子飞过一个磁场，通过检测器检测它转弯的半径，就可以计算出它的质荷比。当然，现在这类质谱仪用得比较少了。接下来我们要介绍的TOF质谱仪更常用。

这是目前很常用的质谱仪类型。它的工作原理是这样的，通过离子源得到离子以后，离子经过一个加速的区域，所有的离子都会获得一个相同的初始动能，然后它们进入一个没有电场的区域，进行自由地飞行！是不是画图很美？由于所有离子的初始动能是相同的，那么重的离子飞行速度就会慢一些，轻的离子飞得快一些，最终离子都会通过整个飞行区域，到达检测器。

通过测量离子的飞行时间，我们就可以推算出离子的质荷比。飞行时间是与质荷比的平方根成正比的。这就有点像跑步比赛，重的离子跑得慢一些，轻的跑得快一些，我们拿一个秒表，通过测定跑步时间，就可以计算出每个离子的质荷比了。这是一种原理很简单的质谱仪，也是目前使用广泛且性能很不错的质谱仪。

TOF质谱仪长什么样呢？我们来看看下面两个图。

这就是典型的飞行时间质谱仪的模样。因为我们要让离子在一个跑道上飞，就像奥运会上的跑步比赛一样，如果离子们都来跑100米，第一名和第二名可能只差0.01秒，区别起来会比较困难。但如果跑3000米，第一名与第二名可能会差10秒，甚至更多。所以跑道越长，我们越容易把离子区分开来。所以飞行时间质谱仪通常都需要有一个很长的飞行区间。

上图是两种典型的TOF质谱仪，左边是AB的4700质谱仪，它是竖着跑的，所以很高，有两米多。右边是Bruker的Ultraflex质谱仪，是横着跑的，长度也有两米多。所以TOF质谱仪的外表特点就是非常长，为了让离子能够尽可能跑得远一些。

除了TOF，还有一类很常用的质谱仪，就是我们经常听到的四级杆质谱仪。

为啥叫这个名字呢？如果我们来观察一下它的横截面，会发现，它是由四根电极组成的，电极的截面并不是完美的圆，而是双曲抛物线。

在横截面上，四根电极分成两组，两个相对的是一组，在相对的电极上加上一个相同的交流电压和直流电压，而在相邻的电极上，则加上相反的交流电压和直流电压，通过叠加交流电压和直流电压，不同质荷比的离子进入四级杆以后，会发生震荡，一边飞行，一边转圈。

当扫描的电压和频率一定的时候，只有特定质荷比的离子才能穿过四级杆，到达检测器。而其它质荷比的离子就会因为偏转太多，而打到四级杆上，或者从缝隙里穿出。

所以，四级杆质谱仪是用来做质量选择，只让特定质荷比的离子穿过质谱仪。通过改变四级杆上的电压，我们就可以让不同质荷比的离子挨依次个穿过质谱仪，到达检测器。

四级杆质谱仪的外观通常都不会很长，在15-30cm左右，结构是比较紧凑。

还有一类质谱仪，与四级杆质谱仪非常相似，它就是离子阱质谱仪。分为两类，一类叫三维离子阱（3D Ion Trap）质谱仪，另一类叫线性离子阱（Linear Ion Trap）。

线性离子阱与四级杆质谱仪长得是非常像的，它的横截图跟四级杆质谱仪是一样的，只是它的侧面开了一个洞，来作离子弹出用的。四级杆质谱仪中，离子是穿过质谱仪飞出去的，而在离子阱质谱仪中，离子不会飞出质谱仪，而是一直在阱里面，沿着右下图像8字型的轨迹飞行。当扫描电压达到一定的数值以后，离子会被射出来。

对于三维离子阱，我们可以理解为，是将线性离子阱无限地压缩，压缩到最后变成这样一个很短的圆环，形成一个陷阱结构。三维离子阱有两个端电极和一对环形电极构成了一个封闭的空间，把离子困在里面。离子“阱”的名字就是这么来的，相当于是一个陷阱，把离子包在里面，一直进行转圈的运动。

离子阱与四级杆一样，可以通过改变加到离子阱上的扫描电压，让不同质荷比的离子射出来进行检测，也可以将特定质荷比的离子留在离子阱里面，进行后续的处理和操作。这是它们与TOF最大的不同，TOF只能检测不同质荷比的离子，却不能选择让哪些离子留下，而四级杆和离子阱既可以检测离子，同时也可以实现离子的选择，将想要的离子留在离子阱中，或者说，让特定的离子穿过四级杆。所以四级杆或离子阱还有一个名称，叫质量过滤器，它可以过滤特定质荷比的离子。

我们要聊的第四类质谱仪是FTICR和Orbitrap，这类质谱是基于离子在电场或者磁场中会作回旋运动，通过测定回旋共振频率，并进行傅里叶变换，从而测定离子质荷比。

我们先来看看FTICR（见下图），它是将离子放到一个高强度的磁场中进行自旋共振，所以需要一个很大的超导磁铁，用来产生一个很强的磁场。

而Orbitrap则克服了必须要使用超导磁场的困难，它使用一个电场来限制离子的自旋共振。

这种类似的质谱仪都有非常高的分辨率，当然价格也很高。

以上就是我们常用的四类质谱仪：磁质谱仪、TOF、四级杆&离子阱、Orbitrap&FTICR，根据它们的原理和作用的不同，可以分为两大类：

• 质量检测器：仅可测定进入质谱仪的不同质荷比离子的丰度（TOF和Orbitrap等），不能选择离子通过质谱仪；

• 质量过滤器：测定不同质荷比离子的丰度，让特定质荷比或质荷比区段的离子通过质谱仪（四级杆和离子阱）。

通过今天的分享，小伙伴们是否对质谱的原理和几种常见的类型有了一个基本的了解呢？下一篇小编将继续分享质谱仪性能的几大指标，如何从使用者的角度对质谱仪进行性能评估。另外，小编还会介绍一下串联质谱是如何协同工作的。感兴趣的童鞋，就请继续关注我们的公众号更新吧~

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