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4位学者亲述:质谱技术分析蛋白相互作用

美吉逾华蛋白组学 2020-04-28 11:22:36

质谱技术已经成为了蛋白质组学研究的主力。这种技术方法能精确的检测多肽,从而帮助研究人员识别并测序多肽分子,分析它们的特征,了解它们如何进行化学修饰的。

但大多数蛋白质并不是单独行动的,一些关键的生物学过程,如DNA 复制、转录、翻译、细胞分裂和能量生成都依赖于大型蛋白复合物的行为,这些蛋白复合物常常涉及几十个亚基,十分复杂,传统的质谱方法难以进行研究。

来自西北大学蛋白质组研究中心的设备主任Philip Compton表示,确实,蛋白复合物难以进行研究,许多类型的分析都用不上。大多数复合物都由非共价作用连接在一起,瞬间组合,或者定位在细胞膜上,因此为样品准备增加了难度。而且虽然一些复合物相对来说富集,但是还是有一些数量很少,这也进一步阻碍了检测和分析。

从质谱技术的角度来说,分析质量大约为500kDa的蛋白复合物,问题在于大小,“对于质谱技术,这么大的尺寸传统技术很难分析,”Compton说。即使你能将它们弄进质谱仪中,也需要一种计算方法来分析存在的蛋白,此外正常的样品准备过程也会令蛋白变性,破坏蛋白复合物。

为此研究人员不断改进质谱技术,希望能通过技术改进来解决这个问题:


确定亚基组成

研究员: 西北大学蛋白质组研究中心的设备主任Philip Compton

项目: 高通量top-down 蛋白质组学

解决方案:

如果说蛋白复合物是洋葱的话,那么Compton就采用了一种逐层剥离的进行研究。他与Thermo Fisher公司的研究人员合作,研发出了一种基于 Orbitrap 的质谱仪,完成被称之为MS3的系统。

Orbitrap 脱胎于由通用电气公司的K. Kingdon于1923年发明的一个称为Kingdon trap的离子捕集装置。经过多年的发展,成为了一种全新的质量分析器。Thermo Fisher也基于此发展出了多种质谱仪,在各个领域发挥着重要的作用。

Compton进行的这种基于Orbitrap 的MS3研究主要就是分析样品中所有复合物,每次大约分析10-15种——通过捕获,放进一个惰性其它分子装置中碾碎,弹碰一个亚基,然后进行称重,测序,再然后就是复核。

由于这一设备还未完全构建成,因此Compton将这些称为“伪-MS3”实验。从本质上来说,这一设备就是分离了蛋白复合物,对碎片进行分析,并重复这一过程(Anal Chem, 85:11163-73, 2013),“我们将这个技术实验拆分成两步,但实际上都是做的同样的事情,”Compton说。

Compton和他的团队已经开始将这用于参与代谢的蛋白复合物研究中。比如乳酸脱氢酶 (LDH) ,一种由两个M (muscle) 和 H (heart) 亚基组成的145 kDa蛋白复合物,它可以有五种构成:MMMM,MMMH,MMHH,MHHH和HHHH。

利用MS3系统,Compton说他可以分辨出不同的蛋白组成,以及亚基可能出现的翻译后修饰,并确定每种修饰的丰度。目前他希望可以利用这种方法定量分析不同细胞和组织类型中LDH的差异。

设备装置:Compton研究组采用的是Thermo Fisher的 Orbitrap-based Q Exactive HF mass spectrometer,这是一种组合型四极杆 Orbitrap 质谱仪,威力巨大。你也可以选择其它相似的系统,如 Exactive Plus EMR Orbitrap system,不过由于EMR缺少Compton定制硬件的“高质分离能力”,因此应用范围可能会受限。他表示,“如果你的复合物相对来说比较纯,那么可以进行这样类似的实验。”


绘制蛋白-蛋白相互作用界面图谱

研究员:麻省大学阿默斯特学院化学教授Igor Kaltashov

研究项目:探讨候选蛋白疗法中蛋白与其分子靶标的相互作用

解决方案:

大多数研究蛋白复合物的实验都需要将这些蛋白复合物完整的放到质谱仪中进行分析,Kaltashov则采用了一种不同的方法,也就是称为氢氘交换 (hydrogen-deuterium exchange,HDX)的技术。

所谓氢氘交换质谱方法,其原理就是将蛋白浸入重水溶液中,蛋白的氢原子将于重水的氘原子发生交换,而且蛋白质表面与重水密切接触的氢比位于蛋白质内部的或参与氢键形成的氢的交换速率快,进而通过质谱检测确定蛋白质不同序列片段的氢氘交换速率,从而得出蛋白质空间结构信息。

除样品制备外,氢氘交换质谱法的主要过程包括:交换反应、终止反应、将蛋白快速酶切为多肽、液相分离、质谱检测、数据解析。氢氘交换质谱技术在蛋白质结构及其动态变化研究、蛋白质相互作用位点发现、蛋白表位及活性位点鉴定方面有着广泛的应用。

Kaltashov 解释道HDX还可以用于分析任何可能改变不同蛋白区域与其溶剂之间的可及性,比如蛋白质折叠和聚集,还有蛋白质-蛋白质相互作用。“一旦两种蛋白质彼此绑定,溶剂就无法接触到其相互作用的界面,并将这反映到氢氘交换动力学上来,”他说,这种改变比较于单个蛋白十分明星。

在2009 年的一篇综述中,Kaltashov介绍了转铁蛋白(一种铁转运蛋白)与其受体的这种过程,经过交换反应后,蛋白会被打碎成多肽,然后逐段分析。他说,一些多肽显示并未出现氢氘交换,这表明这些多肽由于被埋在蛋白核心当中,因此不会曝露在溶剂中。其它的多肽尽管有受体绑定,但是出现了与溶剂相同速度的氢交换,因此它们并不是蛋白-受体界面的组成部分。

还有第三种多肽,在存在和缺少受体的情况下,表现出明显的差异,这些多肽就是蛋白-蛋白相互作用的位点(Anal Chem, 81:7892-99, 2009)。

“实际上你可以定位出这些位点,了解相互作用结合的强度信息,以及界面区域的结构特点,”Kaltashov 说。

需要注意二硫键:如果你希望尝试bottom-up的HDX实验,那么就要小心二硫键,Kaltashov 说。胃蛋白酶能有效的在HDX实验中将蛋白消化成组成多肽,但如果出现多个二硫键时就会造成麻烦。

2014年,Kaltashov 的实验室对这一问题发表了两种解决方案。第一次采用一种叫做电子捕获裂解 (electron capture dissociation ,ECD) 的片段化技术(Anal Chem, 86:5225-31, 2014);另外一种泽斯跳过胃蛋白酶消化这一部,这也就是top-down 分析方法 (Anal Chem, 86:7293-98, 2014)。


蛋白复合物表面拓扑结构

研究员:加利福尼亚大学洛杉矶分校化学与生物化学系教授 Joseph Loo博士生物通

研究项目:研究蛋白质-配体相互作用,以及蛋白质-蛋白质相互作用

解决方案:

Loo博士对复合物识别并不感兴趣,他感兴趣的是蛋白亚基是如何组装的,其中最令他着迷的是,蛋白复合物表面会出现哪些氨基酸残基,哪些又处于复合物中心位置,或者与配体相互作用呢。

这是一个结构生物学问题,他解释说,“它们是如何折叠,能令这些氨基酸残基都向外的呢?”

为了了解这个过程,Loo将两种技术结合在一起:高分辨率傅里叶变换离子回旋共振质谱技术 (FTICR) 与电子捕获裂解技术 (ECD) ,从而组成一种质谱片段化的方法,令质谱仪中铁离子与自由电子相互作用,从而导致蛋白沿着其多肽主干分裂。然后通过高精度检测这些片段,研究人员就能发现蛋白的氨基酸序列了。

但在Loo的研究中,这些碎片并不是沿着蛋白长度均匀一致的。蛋白通常在质谱分析方法中都会发生变性,但Loo研究的蛋白复合物却是完整的,这个过程称为天然质谱分析(native mass spectrometry,生物通译),因此碎片是在复合物表面出现,就像是煮熟的鸡蛋壳中出现裂缝一样。

Loo说,“会得到的序列信息有限,但这些序列信息来自于其特殊的三维结构区域。”(Anal Chem, 86:317-20, 2014)而且这些数据也能显示蛋白-小分子之间的相互作用,Loo解释说,当蛋白发生裂解的时候,配体往往会依附在多肽碎片上。近期其研究组发表的一篇论文就绘制了真核生物乙醇脱氢酶(一种质量为147kDa的四聚体复合物)的锌结合位点 (J Am Soc Mass Spectrom, 25:2060-8, 2014)。

同时Loo也指出,这种技术“还尚未达到其黄金时刻”,他的研究组正在收集蛋白已知结构ECD数据,用以确保他们解析了真正的蛋白拓扑结构。他们也在尝试将研究复合物的大小延伸的更大,目前是限制在800kDa。

如何实现:

FTICR质谱仪能提供高精确度和高分辨率,当然也不便宜。Loo说能直接用到这种仪器的研究人员并不多,但是他们可以尝试申请国家实验室。美国佛罗里达州立大学国家高磁场实验室和太平洋西北国家实验室环境分子科学实验室都对有价值项目开放。


解析蛋白复合物的构架

研究员:俄亥俄州立大学著名学者,化学和生物化学教授Vicki Wysocki

研究项目:整个复合物分析的仪器研发

解决方案:

借助于其在化学分析方面的经验,Vicki Wysocki致力于蛋白复合物的仪器分析。她的实验室研发了一种称为表面诱导解离技术 (surface-induced dissociation,SID)。

这种方法与其它许多种片段化方法一样,都是利用质谱仪中的离子与其靶标碰撞,通常这些靶标都是一些小分子气体分子,碰撞后产生的能量足以打断多肽主干。但是对于大型蛋白复合物来说,当然这个靶标越大越好。在SID技术中,这个碰撞分子就是其能达到的极限:这种技术令蛋白目标粒子用力的撞上了仪器中的一种非反应表面,说得简单点,就是一堵墙,这会导致蛋白复合物碎裂成亚复合物结构,从而揭示这一结构的内容构架。

Wysocki教授将这种方法与离子迁移分散(ion-mobility separation)技术结合,后者是一种根据分子大小和形状进行气相电泳的方法,比如详细分析抗生素生成过程中的一种酶。

研究人员发现这种酶可以分成具有3个亚基结构的两个拷贝,也就是α、β 和γ,它们就像一对三合体相互顶端相连,其中每一个三合体的α和β亚基紧密的连接在一起。 (Anal Chem, 83:2862-65, 2011).

Wysocki教授表示,这种构象数据对于蛋白质工程师来说十分重要,尤其是这种特殊的复合物结构可以形成一个结构生物学gap,“这个蛋白不能结晶,因为对于cryoEM来说,它太小了,而对于NMR来说又太大了,”她说,“而质谱则能做到这一点。”


为何选择质谱技术?

质谱技术也许并不是唯一一种能快速计算出蛋白质结构的方法,但它肯定是最快的,Wysocki教授说。她回忆说到她的一位同事送来了一个自己实验室无法破解的蛋白复合物,“在一个下午之后,我的学生就给了他们结构预测图——这是一个七聚物,上面有一个六聚物环。”

即使实验不成功,Wysocki教授说,这个周转时间也很快,不会耽误事情,而且研究人员也能很快得到实验条件的反馈,从这一点来说,“质谱真的很重要。”


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