Nat. Methods | 抗体识别介导的蛋白质生物素化实现邻近标记
大家好，本周给大家分享一篇Nature Methods上的文章，Biotinylation by antibody recognition—a method for proximity labeling这篇文章的通讯作者是来自希伯来大学的Yosef Gruenbaum和NIH的Francis Collins，前者主要研究核内膜内层的核薄层，后者曾参与过人类基因组工程，也担任过NIH的所长，现在也有在研究核薄层。
蛋白互作组是动态的相互作用，会随着时间，发育阶段，细胞周期进程，或组织类型而改变，鉴定蛋白相互作用可以了解目的蛋白的位置与功能，但是特定的突变对组织特异性蛋白互作组的影响尚未被详细研究，例如核纤层蛋白A/C基因有400多种突变，引起14多种影响组织的表型，他们觉得组织特异性的互作组可以作为一种解释。用标准的免疫共沉淀分析核纤层蛋白组并不现实，因为由核纤层蛋白长纤维产生的不可溶的高度有序结构会引起无关蛋白的沉淀，别的一些方法只能局限于单细胞系，而且不同数据组之间重叠覆盖小。
所以，他们就发展了基于邻近标记的方法，过氧化氢与苯酚生物素存在下，结合HRP的抗体会产生自由基，引起目的蛋白周围的蛋白质生物素化，被链霉素包裹着beads去共沉淀生物素化的蛋白质，再用串联质谱检测。还能用SILAC对比靶标信号与目的区域外的信号，作者又通过检测线粒体基质证实了这种方法的灵敏度与特异性，接着运用于分析在不同条件下多种细胞和组织中的核纤层蛋白A/C的动态互作组。
作者将抗体识别法应用于识别Hela细胞中核纤层蛋白A/C周围的蛋白。通过超分辨显微镜观察到生物素沉积在核膜上，用链霉素Beads抓取生物素化的蛋白，质谱鉴定到核纤层蛋白A/C及其互作体。接着作者欲鉴定与核纤层蛋白病有关的A/C互作体，标记到了组织样品中的核膜，发现核膜的形态不是传统的在细胞核周围光滑的圆球状，例如，肌肉的肌原纤维使得核上产生一些沟壑，这些沟壑与核纤层蛋白A/C和DNA分布相关。作者也利用这种方法观察了过表达早衰蛋白的Hela细胞与早衰症患者纤维原细胞的核膜形态。
本文介绍的抗体识别法不用为了每个目的蛋白建立单独的细胞系或者动物模型，也不会像使用融合蛋白那样失真，但需要单特异性的抗体，而且对一些固定失真不敏感，该方法的标记分辨率无法区分邻近蛋白的直接相互作用。
文章地址：http://www.nature.com/articles/nmeth.4533
文章引用：doi: 10.1038/nmeth.4533
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