专栏 表达融合蛋白时,如何把两个基因拼接起来?

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作者：解螺旋.子非鱼 解螺旋原创

转载请注明来源：解螺旋，医生科研助手

小师弟屁颠屁颠跑过来：师姐，我要表达一个ras加GFP融合蛋白，怎么设计引物？

小鱼：你的GFP标签蛋白在载体里还是要你自己插进去？

小师弟：是我自己插进去。（怎么听来觉得怪怪的······）

小鱼：你打算怎样融合？

小师弟：是不是这样？酶切 A基因，酶切质粒，把A先插入载体，筛选出克隆，然后酶切B基因，用不同的酶酶切质粒，将B基因插入含A的载体。

小鱼：No,何必这么复杂，SOE PCR吧！

小师弟：什么是SOE PCR？

SOE PCR是一种通过寡聚合甘酸链之间重叠的部分互相搭桥、互为模板进行PCR扩增，从而获得目的DNA基因片段的方法。SOE PCR可简单地凭借互补引物，通过PCR迅速地将两段基因连接在一起，成为新的杂交基因片段。

若要将基因A和B连接在一起，假设引物P1、P2扩增基因片段A，引物P3、P4扩增基因片段B；P2、P3为内引物，P2上含有B的序列，P3上含有A片段的互补序列。单独PCR后，P1、P2将A的3'端带有B的5'端的互补序列，P3、P4将B的5'端带有B的3'端的互补序列；将各自PCR产物混合作为模板，变性退火后，A链和B链结合起来，延伸成新的杂交基因，可以将A、B连接起来。（师弟看到这里开始叽咕：这都是什么鬼？）

下面以表达融合蛋白S和A为例，小鱼给大家介绍拼接基因S和基因A的方法,先在NCBI中查找两个基因的mRNA序列，然后利用primer6.0软件，设计扩增基因S和A基因的引物，并去除S的终止子和A基因的起始密码。

关键问题来了，引物要怎么设计？SOE PCR引物设计跟普通PCR引物有什么不同？

• SOE PCR引物比较长，可长达80bp，太短要增加反应次数，提高成本。（土豪可忽略）

• 引物有重叠区域，引物间的overlap region以25~30bp为宜，尽量避免富含AT的序列。

• 考虑引物的TM值，依照“50℃规则“可以设计出可行的重叠区，但也必须全面考虑其他引物的Tm值，在PCR的前5个循环中，采用就低引物Tm值设计退火温度是最好的解决办法。

• 引物长，更要避免自身二级结构、引物二聚体形成等。

在S上游引物5'端加入EcoR V限制性核酸内切酶位点，在其下游引物5'端则加入BamH I限制性核酸内切酶位点、含5个氨基酸残基的柔性肽基因序列(linker序列) 以及基因A的部分5'端序列，在A 基因的上游引物5端加入BamH I、含 5个氨基酸残基的柔性肽基因序列(linker序列)以及基因S的部分3’端序列，在其下游则加入 酶切位点Not I酶切位点。

S (P1): 5'-ATAGATATC GGAGAA CGG GAT ATG TTT AG-3'

S (P2)5'- ATA GGATCC ACC GCC ACC GAC ATTGCC AAC GTA TTT TAAG- 3'

A (P3): 5'-ATA GGA TCC GGT GGC GGT GGC TCC GCT CAA GTA AT C AAC ACT-3'

A (P4): 5'-GCGGCCGC CGACAT CCTATC GACCTAAC-3'

划线部分为酶切位点

接着以S (P1)和S (P2)为引物，含有S基因的cDNA为模板；以A (P3)和A (P4)为引物，含有A基因的cDNA为模板；进行PCR,得到上述产物并鉴定后，将两者混合作为模板，以S (P1) 和A (P4)为引物扩增融合基因S-A。采用两步法循环模式：第一步将两种模板混合后，在不加引物的情况下循环3次；第二步加上引物后，在循环28次。将产物转入载体进行后续的克隆。

引物的结构组成看上去虽然复杂，但设计起来却十分简单，无非就是在普通引物设计的基础上加上重叠区以及一些修饰：

• Gene S 5’端的修饰，gene A 3 ‘端的修饰，比如增加限制性酶切位点进行克隆和表达。

• Gene S 3’端的突变，gene A 5’端的突变，比如进行偏嗜密码子的修改、起始密码子的掺入。

• 在gene S和gene A之间添加DNA linker。

在应用这一技术时，还有几个要注意的问题：

• DNA酶的质量：应避免使用Taq酶，因其在PCR产物3端添加一个突出的A，从而造成移码，翻译蛋白时全部错位，不好意思今天白忙活，去墙角哭会。因此，为了最大限度地避免碱基的错配，一般采用具有3‘-5‘外切酶活性的高保真酶，如TLI DNA Polymerase (Promege)、KOD DNA Polymerase（Toyobo）、Pyrobest DNA Polymerase (Takara)。比起普通酶，这些高保真酶是贵了点，但真的物有所值。

• 模板的来源： 在构建嵌合ORF时，如果选择基因组DNA为模板的话，可能会P出非翻译区，宜选择mRNA作为原始模板。

• 接头序列(Linker)：通过一段适当的核苷酸序列将不同的目的基因连接起来, 使其在适当的生物体内表达成为一条单一的肽链, 使得融合蛋白中的两种成分能分别形成正确的空间结构、 更好的发挥生物学活性。Linker序列就像安排一个人畜无害的小伙伴在性格比较暴躁的两人之间，充当和平使者，避免冲突。

• Mg2+是DNA聚合酶活性的依赖离子，Mg2+浓度过低会影响聚合酶活性，过高会造成非特异扩增。SOE-PCR中：在保证产物扩增效率及特异性的前提下，尽可能降低Mg2+的浓度，这可最大限度地提高DNA 聚合酶的保真性。

今天就小鱼就分享到这，大家记得要好好消化一下！

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