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【Cell】能表达蛋白的lncRNA!

小张聊科研 2019-05-12 10:57:59

长链非编码RNA(Long non-coding RNA, lncRNA)是长度大于 200 个核苷酸的非编码 RNA, 研究表明,lncRNA 在剂量补偿效应(Dosage compensation effect)、表观遗传调控、细胞周期调控和细胞分化调控等众多生命活动中发挥重要作用,成为遗传学研究热点。


但是lncRNA能够拮抗由同一条基因转录的剪切体mRNA所表达蛋白的机制,这个你们知道吗?

 

今天X湿兄给大家带来一篇Cell的文章解读,看看别人家的实验室是如何如何根据实验现象,顺藤摸瓜、庖丁解牛之后发现一种全新的lncRNA作用机制的。

 

 (一)细胞现象:紫外线辐射导致细胞转录的起始、延伸都受抑制


众所周知,凡是影响细胞转录和mRNA正常剪切的因素,会对基因的表达以及细胞存货产生致命影响。紫外线的辐射会剧烈抑制RNA聚合酶II的转录起始、以及转录的延伸,但是具体的机制仍然知之甚少。紫外辐射会严重影响RNA聚合酶II的磷酸化过程、改变其结合DNA的TATA box活性,而且还能导致染色质的修饰重塑,这使得与转录相关的DNA损伤应急机制更复杂。

有研究表明①当有环境压力时,细胞RNA的表达会多样化,以应对压力②很重要的一点是,细胞对于前体mRNA的剪切加工都是随着RNA的延伸就开始了。

于是作者对紫外线辐射造成的基因组范围内的转录过程、转录本的剪切方式进行了研究。

 

(二)紫外线照射导致转录延伸速度立刻下降

1) 检测技术原理:DRB(核苷类似物,导致延伸终止),然后用global run-on sequencing (GRO-seq)对核内新生8,148个转录本进行测序

2) 结果:①辐射导致细胞的RNA转录延伸停滞,转录本的长度立刻变短②被照射2~12小时后,转录延伸的速度变为约40base/min,是正常速度的1/40。

 

(三)RNA聚合酶II结合启动子也受到影响

 

(四)UV辐射诱导不同的转录本形成

作者用二代测序技术检测UV辐射对于转录本剪切方式的影响,作者发现298个基因产生了435个新的转录本。

作者对435个新的转录本进行了分析,发现了6种不同剪切方式,其中alternative last exon (ALE)的转录本最多,占了36%:156 ALE 剪切转录本(105基因),例如基因HERC4、INTS6。

其中78%的ALE转录本长度更短,这也提示ALE short的转录本可能发挥着很大的功能。


(五)这些ALE short对于UV辐射有生理意义吗?

经过分析,84个有ALE short转录本的基因都是和转录过程相关的基因(Gene Ontology数据库),可以大胆滴推断,ALE short估计是为了抵抗UV辐射破坏而产生的,有着重要的生物学意义。

作者又把这些基因和转录相关的DNA损伤应急反应相关的因子数据库进行交叉打分,惊人地发现其中有28个基因的评分最高,得到最高分的叫做ASCC3.

 

(六)顺铂、喜树碱、UV辐射都倾向于表达ASCC3 ALE short

ASCC3正常转录本的长度是373.5kb,ASCC3 ALE short转录本长度是25kb,共有前三个相同的外显子,而第四个外显子是ASCC3 ALE short所特有的。

把细胞暴露于顺铂和喜树碱条件下,也有相似的结果,这说明这种加工方式是一种普遍存在的应急方式。


 

(七)UV辐射后ASCC3蛋白阻碍转录过程(siRNA验证),而ASCC3 ALE short却促进

作者通过siRNA验证了ASCC3 long转录本阻碍了转录。

而ASCC3 ALE short转录本对转录过程却有着促进的效果。


作者又通过CRISPR/CAS9将ALE效应敲除,ASCC3 ALE short无法转录,但是ASCC3 long依然正常表达,结果发现细胞很难再UV辐射后恢复转录。


(八)ASCC3的长短转录本是相互拮抗的吗?

作者尝试从更多的基因转录水平去验证。

① ASCC3 ALE short敲除株:108个基因的表达下调了

② ASCC3 long敲除株:107个基因的转录本上调了


(九)ASCC3 ALE short作为非编码RNA行驶作用

① ASCC3 ALE short是可以表达蛋白序列的,但其表达的蛋白经验证不参与转录调控

 

② 作者构建了转录ASCC3 ALE short的载体,但是人工地在翻译起始就加入了终止子,保证蛋白无法表达,结果发现,ASCC3 ALE short依然能够发挥功能

③ 而且作者用探针原位杂交的方式发现ASCC3 ALE short都集中在细胞核中,敲除了ASCC3 ALE short则没有相应的定位出现。然而ASCC3 long却即出现在细胞核中,也出现在细胞质中。


此案最终可以结案了:ASCC3 ALE short作为非编码RNA发挥功能。

 

 

 

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