伯豪生物高通量核酸和蛋白检测服务(上)

技术概览

上海伯豪生物技术有限公司引进的Luminex200^TM仪器，有机整合了荧光编码微球、双激光检测、应用流体学、最新的高速数字信号和计算机运算法则等多项技术，造就了其无与伦比的检测特异性和灵敏度，可广泛应用于免疫分析、核酸研究、生物标志物筛选与验证、酶学分析、受体和配体识别分析等研究，得到各权威机构和医学界高度认可，是临床诊断领域以及生命科学研究中的一大热点。

Luminex^®xMAP（flexibleMulti-Analyte Profiling）技术又称流式荧光技术，又称液相悬浮芯片技术，该技术的核心是将直径6.5μm的微球（聚苯乙烯微球或超顺磁微球）用荧光染色的方法进行编码，通过调节红色和红外两种荧光染料的不同配比获得可达100种具有不同特征荧光谱的微球，然后将每种编码微球共价交联上针对特定检测物的抗原、抗体或核酸探针等捕获分子，当这些预包被的微球与待检样本杂交孵育时，目标物被微球捕获后，被用生物素标记的特异性检测探针或抗体混合物识别，加入链霉亲和素-PE荧光素底物（SAPE）后发光，并用Luminex^®仪器进行信号读取，通过两束激光分别识别编码微球和检测微球上报告分子的荧光强度。

 图1.Luminex 200^TM仪器的组成

图2.xMAP技术的原理

技术特点

 测定范围广：既能检测蛋白，又能检测核酸；

 微量标本：仅需25μL 样本；

高通量检测：96孔板，80个样本/板，单孔最多可检测100 个指标；

高速度：每块96孔板结果的读取时间≤45min；

灵敏度高：~1pg/ml

线性范围广：检测范围达3.5个数量级；

组合灵活：可个性化组合检测指标成为定制的试剂盒；

低成本：试剂用量少，能有效降低成本。

基于Luminex 200 TM的多重核酸定量分析解决方案

QuantiGene® 2.0 高通量核酸定量研究系列产品是世界著名基因芯片制造商Affymetrix 公司旗下Panomics的畅销产品。

QuantiGene^®Plex除了利用xMAP技术外，还整合了西门子独家授权并经过临床验证的branchedDNA（bDNA）技术，该技术可用于VersantHIV、HBV以及HCV的病毒载量分析，通过信号放大技术，而非模板放大，bDNA技术实现了对模板的直接定量检测。

QuantiGene^®Plex是验证表达谱芯片和二代测序数据、DNA拷贝数检测、临床FFPE样本和血液样本的多基因检测、信号传导通路检测以及转化研究中生物标志物与药物靶点验证研究等的理想工具。

特点优势

多重定量：96孔板，80个样本/板，单孔同时定量检测多达80个目标基因；当样本数与基因数较多时，性价比高于定量PCR。

可测定不同类型的样本：培养细胞、血液或组织（新鲜、冰冻或福尔马林固定、石蜡包埋FFPE等）；

无需抽提纯化RNA或DNA，仅需少量固体或液体样本；

无需反转录RNA；

无需PCR扩增，避免引入误差；

简化的工作流程。

方法比较

实验流程

图3.QuantiGene® Plex多重定量实验流程

服务推荐：

单基因表达精确定量服务：Affymetrix-Panomics QuantiGene® 2.0 Assay

多重基因表达定量服务：Affymetrix-Panomics QuantiGene® Plex 2.0 Assay

DNA拷贝数测定服务：Affymetrix-Panomics QuantiGene® Plex DNA Assay

预设计探针组：Affymetrix已经开发了庞大的已验证基因的探针库，超过1600种探针组，包括超过15000个基因。预设计探针组覆盖了广泛的物种，包括：人类、小鼠、大鼠、犬类、猴、猪、大豆和玉米等诸多物种，任何现有基因的组合都可以整合设计新的探针组，要了解最新的探针组和基因信息，可访问www.panomics.com或者联系我们。

定制探针组：Affymetrix可针对任何基因以及任何物种提供定制探针服务。定制分析组合为3-80 plex（RNA）和3-33 plex（DNA）。客户只需提供基因列表、参考序列ID或者DNA序列，即可在两周内完成设计。

应用案例

01

mRNA靶标验证

使用AffymetrixGeneChip® Arrays对炎症通路激活的特征基因表达进行鉴定。继而通过使用QuantiGenePlex（QGP）和qPCR分析对经LPS处理的小鼠样本进行测试以进一步验证该特征。收集52只处理后和未处理的小鼠脾脏，制备组织裂解物进行QGP分析，同时纯化RNA进行qPCR测试。处理后，QGP和qPCR分析均显示出类似的上调或下调模式。但是相比于qPCR，QGP分析可提供更准确和精密的结果。在本研究中，必须处理14块qPCR反应板才能获得一块QGP反应板相当的信息。EbsworthK. Gene expression analysis by Quantigene Plex: validation and applications.Planet xMAP USA; 2007 March 12-14; Laguna Hills, CA.

 

优点：通过测试简单的裂解物，QGP分析无需qPCR所需的耗时较长的RNA纯化以及逆转录步骤，从而可避免昂贵的开支和误差。QGP分析具有高稳定性、高准确性及高精密度的特点，而多重定量分析又可提高效率，并节省样本。

图4.QGP和qPCR的炎症相关基因验证的结果比较

02

验证FFPE样本的表达谱基因芯片标记

使用GeneChip®Human Exon 1.0 ST芯片，筛选19个宫颈鳞状细胞癌（SCC）和9个恶性腺瘤（AC）FFPE样本以找出区分SCC和AC的分子标记。FFPE组织块已存储了平均12年（10-16年）的时间。在对该基因芯片的数据进行分析之后，设计了QuantiGene26-Plex基因检测试剂盒，并成功验证了19个宫颈鳞状细胞癌和9个宫颈恶性腺瘤FFPE样本。Hall,et al. British Journal of Cancer 104:971-981 (2011).

 

优点：已知福尔马林可以对RNA进行降解和化学修饰，这可能是使用DNA聚合酶进行模板放大步骤的分析方法中会产生的问题。QuantiGenePlex分析FFPE样本不存在该问题，因为分析基于杂交原理，无需进行RNA纯化或放大。

图5.FFPE样本的癌症基因表达分析

03

DNA断裂点分析

QuantiGenePlex DNA Copy Number Assay用于检测SKBR3乳腺癌细胞和对照细胞系（正常皮肤纤维母细胞和MDA-231细胞）染色体17上Her2和相邻基因的DNA断裂点，以及染色体1、5和8上的对照基因。正如预期的一样，检测到了Her2拷贝数7倍放大（标准比值为6.5）。QuantiGenePlex结果与bDNAFISH分析一致，其中SKBR3细胞中可以检测到14个拷贝，而在HeLa细胞中可以检测到2个拷贝，这与预期一致，同样是7倍放大。对Her2的两个相邻基因PNMT6和GRB7，也可以检测到7-8倍的放大，而对照基因则检测到预期的单倍拷贝数。

 

优点：QuantiGenePlex DNA Copy Number Assay可以检测到给定染色体上的单拷贝DNA变化，从而进一步分析DNA断点变化，在96孔板上，该分析可以在一个加样孔中同时定量检测最多33个区域。

图6.A. DNA拷贝数分析染色体断裂点；B.bDNA FISH验证

伯豪生物，定量服务金标准