湿兄,检测磷酸化蛋白要加磷酸酶抑制剂吗?

2023-05-10 14:56:27

最近很多人问毛老师关于磷酸化的问题。

比如：要检测的蛋白有磷酸化的，要加磷酸酶抑制剂吗？在做 erk1/2 磷酸化表达实验，提取总蛋白的时候需要加入磷酸酶抑制剂，什么抑制剂比较好？

答案是：当然必须一定要加啊！毛老师来给大家简单解释一下。

许多生物学过程和通路的调节都伴随着磷酸酯的形成和去除。而蛋白的磷酸化状态的平衡是由蛋白激酶和磷酸酶相互影响达到的。

其中一个重要的步骤就是准确的观察一般和特异的磷酸化状态。在细胞裂解的过程中溶酶体释放大量蛋白酶对磷酸化蛋白会产生极大影响，所以需要磷酸酶抑制剂对磷酸化状态进行有效保护。

无数经验和实验证据表明：使用 western blot 检测磷酸化蛋白时，一定要在细胞裂解液中加入蛋白酶抑制剂，还要加入一定量的磷酸酶抑制剂，否则即使出来条带也会很浅，给后继定量分析造成困难。

磷酸酶抑制剂可以自己配制，也有商品化的 cocktail 可直接购买。

像 erk1/2 的磷酸化有 THR 磷酸化和 tyr 磷酸化，所以要有 ser/thr 磷酸酶抑制剂和 tyr 磷酸酶的抑制剂。

一般自己配制略显麻烦，考虑的因素比较多，效果不一定好，很多商品化的 cocktail 操作简便，混合的抑制酶覆盖全面，抑制效果表现优秀，可极大地节约时间，增加实验的可重复性。

这里推荐一款罗氏的 PhosSTOP 磷酸酶抑制剂混片剂，是一种即用型的片剂，其中的一些磷酸酶抑制剂只需要纳摩尔级的量。无需花费漫长的时间寻找合适的磷酸酶，也不必繁琐的称量和混合。

PhosSTOP 可应用于多种细胞提取物中磷酸酶的抑制作用，可同时持续抑制包括酸性和碱性磷酸酶，及丝氨酸/苏氨酸蛋白磷酸酶（PP1,PP2A,PP2B）和酪氨酸蛋白磷酸酶在内的多种磷酸酶。

除了有效抑制目的蛋白的去磷酸化，PhosSTOP 也不会影响后继的蛋白检测（例如：western blot）或是蛋白浓度检测（例如：BCA 或是 Bradford）。

有需要的同学可以扫描二维码查看。

文章来源：毛阿懋

图片来源：丁香通

题图来源：丁香通

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