福建水产设备联盟

蛋白质的定量定性检测知多少

生物100 2019-05-27 15:55:28


生物100(bio1297)——很用心的生物学,有态度的自媒体,关注中、高考和教学、科普的平台。点击标题下蓝字“生物100”免费关注,我们将为您提供有价值的生物学、有意思的生物学。


蛋白质定性分析 :确定样品中是否有蛋白质存在,以及存在的是何种蛋白质。

蛋白质定量分析 :确定样品中总蛋白含量,或者某种单一蛋白成分的含量。

1 颜色反应

蛋白质分子中某种(某些)基团能与部分显色剂作用,产生特定的颜色反应,可以对蛋白质进行定性检测。不同蛋白质因含不同的氨基酸,颜色反应便不同。

常用的蛋白质或氨基酸的颜色反应↑

另外,通过燃烧能否产生烧焦羽毛的气味也能检验蛋白质的存在。


2.定量检测

(1)凯氏定氮法:生物体内的含氮物质以蛋白质为主,而各种蛋白质的含氮量很接近,平均为16%,因此只要测定生物样品中的含氮量,就可以推算出蛋白质的大致含量。计算公式:蛋白质的含量=每克样品含氮×6.25。

(2)紫外检测法(紫外光谱吸收法):色氨酸、酪氨酸的最大吸收峰在280nm附近,而大多数蛋白质含有这两种氨基酸残基,所以测定蛋白质溶液280nm的光吸收值可以快速简便地分析溶液中蛋白质的含量。

芳香族氨基酸的紫外吸收↑

所需时间:几分钟

优点:①速度快②对蛋白质无破坏性。

缺点:①不是严格的定量,适用于测定蛋白质粗提液②核酸可引起强干扰作用。

灵敏度:0.2 mg/ml~2 mg/ml

计算方法:①标准曲线法②蛋白质浓度 (mg/ml)=1.45×A280-0.74×A260


(3)考马斯亮蓝染色法:考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式。在一定浓度的乙醇及酸性条件下,可配成淡红色溶液,当与蛋白质结合后,产生蓝色化合物,反应迅速而稳定。蓝色复合物在595nm波长处具有最大光吸收值,并与溶液中蛋白质浓度成正比,因此可检测595nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。

所需时间:10分钟

优点:①快速(反应时间仅需2 min)②敏感,几乎没有蛋白质损失。

缺点:①对各种纯化蛋白质反应不同用这种测定方法对蛋白质引起不 可逆的变性

灵敏度:25 ug/ml~200 ug/ml

计算方法:标准曲线法


(4)Lowry检测法:酪氨酸和色氨酸能与Folin—酚试剂发生氧化还原反应,生成深蓝色复合物,其在745—750nm处有最大吸收峰,颜色的深浅(吸收值)与蛋白质浓度成正比,可根据750nm的光吸收值大小计算蛋白质的含量。这一标准、快速的蛋白质定量检测方法已得到广泛应用,在检测之前可通过蛋白质沉淀将干扰物质去除

所需时间:40分钟

优点:①一种可靠的蛋白质定量方法②不同蛋白质之间差别很小。

缺点:①干扰物质多反应速度慢。③某些试剂不稳定④使蛋白质发生不可逆变性。

灵敏度:5 ug/ml~100 ug/ml

计算方法:标准曲线法


(5)BCA(二喹啉甲酸)检测法:在碱性环境下蛋白质分子中的肽键能与Cu2+还原成Cu+。而BCA试剂可敏感特异地与Cu+结合,形成稳定的紫色复合物,在562nm处有最大光吸收值。颜色的深浅与蛋白质浓度成正比,可根据的光吸收值大小计算蛋白质的含量。这是近年来新研制的一种改进的Lowry测定法,反应简单而且几乎没有干扰物质的影响。

优点:①单一试剂终产物稳定。③与Lowry法相比几乎没有干扰物质的影响。

缺点:①反应时间长使蛋白质发生不可逆变性。

灵敏度:①标准检测: 10 ~ 1200 ug/ml;②微量检测: 0.5 ~10 ug/ml

计算方法:标准曲线法


(6)甲醛滴定法:用甲醛处理氨基酸的水溶液,可使氨基中的氢离子被释放出来,再用碱滴定氢离子,从而测定氨基酸的含量。


说明:资料来自学科专业知识和网络课件,转载请注明出处:

生物100(ID:bio1297)

相关阅读:

1.中学生物学中的颜色反应群集

2.实验|检测生物组织中的糖类、脂肪和蛋白质

3.双缩脲试剂可以检测蛋白质,是由于蛋白质有?双缩脲试剂能用于检测氨基酸、二肽、尿素、多肽吗

4.公开课实录课:生命活动的主要承担者——蛋白质复习课