FISH-Flow:高通量检测单细胞中RNA和蛋白质的新方法

       大约20年前，Robert Singer及其同事开发出单细胞荧光原位杂交（single molecular RNA FISH, 简称sm-FISH或smFISH）方法。它已被证明是在细胞水平上研究RNA定位的宝贵工具。与RT-PCR不同，sm-FISH用许多短的寡核苷酸探针（大约20个碱基）来靶定单个转录本。研究人员在每条探针上连接单个荧光基团，继而在显微镜下观察微弱的荧光。

        之后，为了提高这种技术的可靠性和普适性，来自LGC Biosearch公司的科学家对该方法进一步优化，在同一RNA上连接大约50个寡核苷酸探针（Stellaris smFISH)，并开发了一套专业化的探针设计与合成流程。这样一来，不仅探针设计变得简便快捷，探针特异性和灵敏度也大大提升，多条探针捕获同一RNA，每个RNA分子都发出强烈的荧光，在显微镜下清晰可见。近年来，这种技术又与免疫荧光（IF）完美结合，以便同时观察、定位和定量每个细胞中的蛋白质和RNA。

        尽管这是一种强大的方法，但一方面受显微镜视野的限制，要分析大量细胞，仍然是相当费时费力的；另一方面受玻片上样量限制（小样本量），要分析细胞群体行为和鉴定罕见细胞亚群特定的表达模式也不太可能。

        近日，美国罗格斯大学的Sanjay Tyagi及其同事将Stellaris smFISH与流式细胞术整合，开发出一种新方法，解决了这一挑战，并将该技术称为FISH-Flow。通过流式细胞仪，他们成功实现了高通量sm-FISH和免疫荧光分析，可同时检测多种类型单细胞中的RNA和蛋白质。这项成果发表在《Nature Protocols》杂志上。

        Tyagi表示：“尽管sm-FISH有着检测单分子的灵敏度，但必须对大量细胞进行成像，才能了解细胞群体的整体行为。将单细胞sm-FISH转移到流式细胞仪，避免了高倍数成像带来的艰巨工作，因为现在可以一次分析数千个细胞。与其它RNA流式检测技术相比，Stellaris smFISH由于操作简单，不需要额外的信号放大和洗涤步骤，加上技术本身信噪比高，是BD自动化操作平台的完美搭档！”

        Tyagi的团队首先在HeLa细胞中利用c-fos和GAPDH Stellaris smFISH探针进行了检验，并利用显微镜和流式细胞仪来观察荧光（Figure 2）。他们还证实，干扰素-γ（IFN-γ）在CD3阳性和阴性活化的T细胞中表达，干扰素诱导的GTP酶（IRGA6）在小鼠巨噬细胞中表达（Figure 1）。最后，他们采用FISH-Flow的方法标记了4种细胞表面markers （CD3、CD4、 CD8和CD56）和IFNG mRNA比较了PBMC细胞群体中干扰素-γ的表达（Figure 3）。

       当然，FISH-Flow也有一些限制。例如，FISH-Flow无法像基于显微镜的方法一样，观察到RNA的亚细胞定位（该局限可通过带有成像功能的流式细胞仪得以克服）和对RNA拷贝数进行绝对定量。此外，基因的表达水平通常比蛋白低，因此基于RNA流式产生的荧光强度通常会比基于蛋白的稍弱一些。

        尽管如此，与基于显微镜的Stellaris smFISH一样，FISH-Flow适用于绝大多数RNA（包括病毒RNA和非编码RNA），且不受抗体限制。加上流式细胞术高通量特性，FISH-Flow使得一次性同时分析成千上万个细胞RNA和蛋白的表达模式成为可能！只要包含阳性对照和阴性对照，细胞是健康的，且细胞没有固定太久，FISH-Flow适用于大多数荧光探针-抗体组合。

smFISH更多应用：

1.    Stellaris smFISH检测植物LncRNA

2.    Stellaris smFISH检测病毒RNA

       Stellaris smFISH是LGC Biosearch公司明星产品，基因有限公司作为LGC Biosearch授权一级代理，自1992年成立以来，致力于为科研人员引进国内外先进技术，欲进一步了解Stellaris smFISH技术及更详细的产品信息，敬请留言或直接联系基因有限公司。

来源：生物通