ncRNA介导的蛋白甲基化/去甲基化调控基因表达

摘要

本文报告的是甲基化/脱甲基多梳蛋白质(Pc2)调控生长应答信号中的生长调控基因在多梳体(PcGs)和染色质间颗粒(ICGs)间的转移。这种转移是甲基化和未甲基化的Pc2分别与ncRNAs TUG1和MALAT1/NEAT2结合的结果。这些ncRNA介导辅阻遏物/辅活化因子的装配作为组蛋白编码“阅读器”识别开关的标志。此外，NEAT2结合到去甲基化的Pc2上促进E2F1类泛素化激活生长调控基因的转录表达。这些描绘了一种将亚核结构特异的ncRNAs和非组蛋白的甲基化作用与细胞核内的转录单元的重新定位联系起来，从而实现了协调的基因表达程序的分子途径。

图解：在细胞生长的G0期，E2F1靶标基因启动子上的多梳蛋白Pc2处于甲基化状态并且基因位于细胞核中的转录抑制体PcG中，这时甲基化的Pc2与ncRNATUG1结合互作使基因转录受到抑制。当细胞受血清刺激时，细胞中的组蛋白去甲基化酶KDM4C作用于甲基化的Pc2使其去甲基化，去甲基化的Pc2与ncRNANEAT2结合互作并将基因重新定位于适合基因转录的ICGs中，同时去甲基化的Pc2介导E2F1类泛素化激活基因的转录。

1、Pc2甲基化/去甲基化修饰调控细胞生长。

（1）  Pc2是Suv39h1甲基转移酶的非组蛋白底物

 Suv39h1是组蛋白的甲基化修饰酶，作者首先对Suv39h1的非组蛋白候选底物进行体外的甲基化实验，表明Suv39h1在体外能Pc2蛋白进行甲基化修饰（图A）。然后分别用Suv39h1野生型和突变蛋白与Pc2孵育检测其甲基化表明Pc2的甲基化需要Suv39h1的酶活性（图B）。在对Suv39h1进行敲低和过表达细胞的Pc2甲基化检测表明Suv39h1敲低使Pc2甲基化降低，Suv39h1过表达使Pc2甲基化升高。

（2）  KDM4C介导的Pc2K191me2去甲基化激活E2F1靶标基因表达

作者发现了一个有趣的现象：Pc2K191的甲基化序列和组蛋白H3K9的甲基化序列十分相似。这个现象使作者想到是否H3K9的去甲基化酶也能够使Pc2K191me2去甲基化，于是作者通过纯化获取几种H3K9去甲基化酶蛋白然后进行体外的去甲基化实验，表明除了能使H3K9me2去甲基化外，KDM4C也能使Pc2K191me2去甲基化，而其他的去甲基化酶不能使Pc2K191me2去甲基化（下图A），KDM4C的突变不能使Pc2K191me2去甲基化（下图B）。

为了研究Pc2对细胞生长的影响，作者下一步分析了KDM4C介导的Pc2K191me2去甲基化对E2F1靶标基因的转录活性的调控，作者通过血清处理细胞后的ChIP实验检测E2F1靶标基因启动子的Pc2甲基化，表明血清处理后相关基因启动子富集的Pc2甲基化修饰水平显著降低（下图A）。然后对细胞进行KDM4C进行过表达后用ChIP实验分别检测基因启动子上富集的KDM4C和甲基化的Pc2K191me2，表明KDM4C过表达后其在基因启动子上富集增加使的Pc2甲基化水平降低（下图B和C）。最后作者用用血清诱导正常细胞和KDM4C敲低细胞后检测E2F1靶标基因mRNA水平,表明血清诱导使KDM4C正常的细胞E2F1靶标基因mRNA表达上升（下图D）。

（3）  Pc2的甲基化/去甲基化调控细胞生长进程

 作者在说明了血清诱导KDM4C促进Pc2K191me2的去甲基化激活E2F1靶标基因的转录后，又检测了血清诱导Pc2K191me2去甲基化后的细胞生长情况，说明Pc2的去甲基化促进细胞生长。

2、Pc2与ncRNA互作促使相关基因在PcG和ICGs中转移。

（1）  血浆诱导使E2F1调控的基因在PcGPcG和ICGs中重新定位

  作者推测由于Pc2参与稳定的基因抑制，E2F1调控的生长相关基因在血清刺激后可能会从细胞核中的转录抑制PcG体内迁移到允许转录的环境中。作者首先通过免疫荧光原位杂交的方法，分别检测PcG体的标志蛋白Bmi1/Ring1A和ICGs标志蛋白SC35与Pc2在细胞内的定位，表明甲基化的Pc2位于PcG体内，而非甲基化的Pc2则位于ICGs中（下图A、B、C）。之后作者又对E2F1的靶标基因RBL1和MCM3进行定位，发现正常培养条件中这些基因位于PcG体中，当细胞受血清刺激时这些基因则位于ICGs中（下图D和E）。说明血清刺激促使甲基化的Pc2去甲基化并将想基因从PcG体迁移到ICGs中。

（2）  Pc2与ncRNA的互作与生长相关基因的定位和转录调控相关

ncRNA可作为形成亚核体并维持其完整性的组分，由于甲基化和未甲基化的Pc2分别定位于PcG和ICG，并且染色体能够结合RNA，因此作者检测了Pc2可能结合这些亚核结构中的特定ncRNA的可能性。通过用Pc2K191me2或Pc2K191抗体CLIP实验，发现在UV交联之后形成特定的RNA-甲基化的Pc2和RNA-非甲基化的Pc2复合物，在细胞裂解物中添加Pc2K191me2和Pc2K191抗体的阻断肽时，复合物被明显破坏（下图A），对Clip获得的RNA序列分析表明甲基化的Pc2结合ncRNA TUG1（已知的基因抑制RNA）,非甲基化的Pc2结合ncRNA NEAT2/MALAT1（ICGs标志的RNA）。然后作者通过用生物素标记的ncRNA片段进行RNA pull-down实验反向验证了ncRNA TUG1与甲基化的Pc2结合，ncRNA NEAT2/MALAT1与非甲基化的Pc2结合（下图B）。

前面已经说明血清诱导使甲基化的Pc2去甲基化促进相关基因的表达，为了说明ncRNA TUG1和ncRNA NEAT2/MALAT1对基因表达的影响，作者分表对细胞进行ncRNA TUG1和ncRNA NEAT2/MALAT1敲低处理，然后分别检测血清诱导的未诱导的细胞相关基因mRNA的表达，表明ncRNA TUG1敲低后基因表达升高，ncRNA NEAT2/MALAT1敲低后基因表达下降（下图C）。

总的来说就是ncRNA TUG1与甲基化的Pc2结合抑制基因的表达，ncRNA NEAT2/MALAT1与非甲基化的Pc2结合促进基因表达。

3、非甲基化Pc2介导的血浆诱导E2F1类泛素化与基因转录激活相关

作者接下来检测了未甲基化的Pc2在生长相关基因激活中的功能。细胞裂解物的E2F1免疫沉淀物的免疫印迹表明血清刺激诱导的类泛素化修饰的E2F1升高，这是由翻译后修饰引起的（下图A）。在寻找负责E2F1类泛素化修饰的细胞组分时发现到Ubc9和Pc2消耗使E2F1类泛素化减少（下图B）。当Pc2与Myc-SUMO1共转染时，细胞体内的E2F1 类泛素化的显着增加，体外实验更进一步证实了Pc2直接介导E2F1类泛素化的事实（下图C）。

文献原文：Liuqing Yang，Chunru Lin，Wen Liu，et al. ncRNA- and Pc2Methylation-Dependent Gene Relocation between Nuclear Structures Mediates GeneActivation Programs[J].Cell,2011,147,773–788

微信ID：gzscbio

长按二维码关注微互动