磷酸化真的如传说中那么难吗?

2023-05-18 23:00:13

Hello，hello！上次我们的甲基化检测小课堂不知道大家有没有参与进来呢？在开始今天小课堂之前可以先回顾一下上期内容：中科新生命蛋白质甲基化检测小课堂开课咯！

好，今天第二期小课堂依旧是围绕修饰展开——磷酸化的那些事儿~

首先一起来认识一下它▼▼

蛋白磷酸化是指在激酶催化作用下把ATP或者GTP的磷酸基团（P04）转移到不同种类的氨基酸上（主要包括丝氨酸S、苏氨酸T、酪氨酸Y），从而使蛋白质发生翻译后修饰的过程。该修饰是蛋白翻译后修饰（PTM）中最为重要的形式，具有显著的生物学功能，细胞增殖和凋亡，良性发育，信号转导，新陈代谢，肿瘤发生等过程都有磷酸化蛋白的插足，如果小伙伴想玩点科研新花样，又想增加课题深度（探究生物学病变机理），磷酸化修饰组学，是一个不错的选择！

那么问题来了，如何鉴定磷酸化蛋白呢？老顽童立刻说：“Western Blotting是检测磷酸化蛋白的经典方法”，靖哥哥慢吞吞回复：“WB无法实现高通量，好抗体千金难求，实验超级难做，气死宝宝了”，聪明的小黄蓉就发言了：“蛋白组学的高精度质谱平台才是必由之路嘛，不过检测之前，得先记得富集磷酸化肽段！”

目前，研究和应用比较纯熟的磷酸化富集方法主要有三种：TiO2富集；IMAC富集和酪氨酸磷酸化CST基序抗体。

TiO2富集

原理：

TiO2是最常用、发展最成熟的一种富集介质，富集效率高达95%。在酸性条件下，TiO2表面带正电荷，可以与磷酸化肽产生静电作用而达到吸附和纯化的目的。

富集流程：

IMAC富集

原理：

固相金属亲和色谱（Immobilized metal affinity chromatography, MAC）利用磷酸化基团与固相化的Fe3+、Ga2+和Cu2+等金属离子的高亲和力来富集磷酸肽。

富集流程：

pY-1000基序抗体富集

原理：

酪氨酸磷酸化的相对比例极低，只占磷酸组的1%，但在肿瘤领域和细胞信号转导方向却是重中之重。用上述TiO2和IMAC方法很难富集到，目前利用基序抗体在肽段水平上免疫富集酪氨酸磷酸化是分析此磷酸化的首选方法。

富集流程：

总结一下

除了上述常规的方法外，还可以尝试两种或者三种富集方法串联，这样能够鉴定到磷酸化更全面的信息。当然，会有一些喜欢iPhone X的小伙伴会说，还有没有升级版？答案当然是有的，例如HIFU-TiO2和Ti4-IMAC，感兴趣的童鞋可以参考文献（DOI:10.1021/acs.analchem.7b02078）。

总之，磷酸化富集方法正在多样化发展，简单的方法汇总见下图，希望能给大家一些帮助。