【实验Protocol】蛋白质浓度测定之BCA法
BCA 蛋白质浓度检测法，近些年被科研工作者广泛选用，是目前最常用测定蛋白质方法之一。
➤ 原理
BCA（bicinchonininc acid）与二价铜离子的硫酸铜等其他试剂组成的试剂混合一起即成为苹果绿，即 BCA 工作试剂。在碱性条件下，BCA 与蛋白质结合时，蛋白质将 Cu2+ 还原为 Cu+，工作试剂由原来的苹果绿色变为紫色复合物。562 nm 下其光吸收强度与蛋白质浓度成正比。
BCA 蛋白浓度测定试剂盒
➤ 成分
试剂 A | 100 mL |
试剂 B | 2 mL |
标准蛋白（BSA） | 1 mL×2，1 mg/mL |
➤ 保存条件
运输温度：室温（标准蛋白 4～8 ℃ 运输）
保存温度：室温（标准蛋白 -20 ℃ 保存）
有效日期：12 个月
➤ 使用方法
——方法一：96 孔板法——
1. 配制 BCA 工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液。充分混匀。
2. 将蛋白标准品按 0 μL，1 μL，2 μL，4 μL，6 μL，8 μL，10 μL 加入 96 孔板的蛋白标准品孔中。加灭菌双蒸水补足到 10 μL。取 10 μL 待测样品加入 96 孔板的待测样品孔中。每个测定要做 2～3 个平行。
3. 向待测样品孔和蛋白标准品孔中各加入 200 μL BCA 工作液（即样品与工作液的体积比为 1:20），混匀。
4. 37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。
5. 酶标仪 562 nm 波长下测定吸光度。
6. 制作标准曲线。从标准曲线中求出样品浓度。
——方法二：试管法——
1. 配制工作液：根据标准品和样品数量，按 50 体积试剂 A，1 体积试剂 B 配制适量 BCA 工作液，充分混匀。工作液配制的量要与测定所用的比色杯对应。每个测定要做 2～3 个平行。本处列举的比色体系所用的是 0.5 mL 的比色杯。如比色杯规格不同，体系需要放大到实验将采用的比色杯准确读数所需要的体积。
2. BSA 标准品和样品的准备：样品用水或其它不干扰显色反应的缓冲液配制，使待测定的浓度位于标准曲线的线性部分。每个反应准备 3 个平行测定。标准曲线一般 5~6 个点即可。根据样品的估测浓度确定各点的具体浓度。稀释 BSA 时可以用水或与样品一致的溶液。如待测样品的浓度约为 200 μg/mL，可按下表的次序加入 BSA 标准品、样品及 BCA 工作液。
3. 取适量体积的标准蛋白，以蛋白液：工作液=1:20 的比例混匀。37 ℃ 温浴 30 min。冷却至室温。
4. 将样品与标准品在 562 nm 波长下测定吸光度。
➤ 试剂盒
abcam 授权代理商--西宝生物，详询热线：400-024-1858
| 商品名称 | 品牌 | 货号 | 包装规格 |
| BCA protein assay kit reducing agent compatible (test tube) | Abcam | ab207004 | 250test |
| BCA protein assay kit reducing agent compatible (microplate) | Abcam | ab207003 | 1000test |
| BCA protein assay kit for low concentrations | Abcam | ab207002 | 2500test |
| BCA Protein Quantification Kit | Abcam | ab102536 | 1000test |
文章来源网络
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