线粒体乙酰化:蛋白组学,sirtuins去乙酰化酶, 以及对代谢和疾病的影响

线粒体sirtuins：SIRT3、SIRT4和SIRT5是蛋白去乙酰化酶

第一个线粒体去乙酰化酶SIRT3的出现，表明线粒体中也存在乙酰化修饰。SIRT3是NAD⁺依赖的去乙酰化酶，以乙酰辅酶A合成酶2为靶点。早期的研究发现SIRT3缺失的小鼠线粒体蛋白乙酰化显著增加，说明SIRT3是主要的线粒体蛋白去乙酰化酶。而SIRT4或SIRT5缺失的小鼠则没有出现明显的线粒体蛋白乙酰化的增加，说明SIRT4或SIRT5仅调控一部分蛋白的乙酰化修饰。SIRT4是目前所知最少酶活性的线粒体sirtuins。最近有研究发现SIRT4有微弱的蛋白去乙酰化酶活性，作用于小部分的底物蛋白。（图1）

图1. SIRT3~5调控的线粒体乙酰化修饰

SIRT3调控线粒体蛋白乙酰化修饰

2006年首次报导了赖氨酸乙酰化的蛋白组学研究，结果发现细胞质和细胞核中有195种蛋白的388个乙酰化位点，而在195中蛋白中，仅有13种已知蛋白，更加有趣的是，超过一半的乙酰化位点和蛋白定位于线粒体。这项研究表明赖氨酸乙酰化也存在于线粒体中，构成了独特的线粒体乙酰体调控的网络框架。

研究也发现乙酰化修饰是一个调控蛋白与蛋白相互作用的重要方式。细胞乙酰化修饰影响了细胞功能的方方面面，质谱分析的结果显示乙酰化的蛋白涉及多条代谢通路，包括脂肪酸代谢、糖酵解途径、三羧酸循环及尿素循环。动物实验发现SIRT3缺失的小鼠蛋白呈高度乙酰化状态。进一步对线粒体蛋白纯化的分析结果显示，136种蛋白乙酰化水平在SIRT3缺失的小鼠中显著增加。Choudhary等分离野生型及SIRT3缺失小鼠的胚胎成纤维细胞，对蛋白乙酰化位点进行鉴定，发现在众多的乙酰化位点中，超过100个位点在野生型及缺失型小鼠中的乙酰化存在2倍差距。而SIRT3缺失小鼠中蛋白乙酰化位点的增加大部分存在于线粒体内，这些蛋白与三羧酸循环及脂肪酸代谢呈现出良好的相关性。Coons和Denu等的研究发现热量限制（calorie restriction，CR）改变了线粒体蛋白的乙酰化水平。他们通过对野生型及SIRT3缺失型小鼠分别分为正常饲养组及热量限制组，鉴定出3285个乙酰化位点，其中包括434种线粒体蛋白的2193个乙酰化位点。四组不同的处理出现三类乙酰化位点，第一类与SIRT3的表达相关，第二类在能量限制的情况下增加，第三类则在三种处理条件下变化都很微弱。

SIRT5调控酸性酰基修饰、赖氨酸琥珀酰化、丙二酰化及戊二酰化修饰

Hening Lin团队在试图解释SIRT5缺失去乙酰化酶活性时发现了SIRT5的底物结合口袋区域存在一个精氨酸残基，意味着SIRT5可能结合并以酸性酰基蛋白为靶点。体外实验发现SIRT5存在NAD依赖的去琥珀酰化酶活性，体内实验也间接验证了这一点。另一项研究也证实SIRT5调控赖氨酸琥珀酰化及丙二酰化修饰。来自两个不同实验室的研究采用SIRT5缺失小鼠的肝组织和小鼠胚胎成纤维细胞进一步对此进行了验证，发现779种蛋白的2565个琥珀酰位点。KEGG通路分析发现线粒体支链氨基酸（BCAA）代谢和TCA循环是两条最主要的通路。

Verdin和Gibson等发现丙二酰化蛋白存在于多种组织中；SIRT5缺失时，丙二酰化蛋白在肾脏及肝脏中广泛存在，尤其存在于细胞质。这项研究与存在于线粒体内SIRT5依赖的琥珀酰化修饰形成了鲜明的对比。对SIRT5野生型及缺失型小鼠肝脏组织进行质谱分析，结果鉴定出430种蛋白的1137个丙二酰化位点，其中183个位点在SIRT5缺失组表达增加。通路分析SIRT5调控的蛋白主要集中在糖原合成和糖酵解途径通路，其次是尿素循环通路。

逐渐显现的受SIRT4调控的酰基化修饰 

对第三个线粒体sirtuins家族分子SIRT4的研究滞后于SIRT3及SIRT5，但近来的研究也逐渐阐明SIRT4的功能。一项研究发现SIRT4调控丙酮酸脱氢酶的赖氨酸脂酰化及生物素化。之前也有报道SIRT4作为一种核糖基转移酶，调控胰岛素分泌。最近也发现SIRT4调控的酰基修饰位点，如甲基戊二酸、羟甲基、戊二酸。重组SIRT4可以去除这些赖氨酸残基的修饰，SIRT4过表达也使得这些赖氨酸酰基化修饰水平降低。

线粒体蛋白酰基化修饰是如何发生的

在细胞核中，组蛋白乙酰基转移酶的活性与多种转录激活子相关，如GCN5、PCAF、p300/CBP及MOF。这些分子使组蛋白及与转录调控相关的非组蛋白赖氨酸残基发生乙酰化。组蛋白乙酰化在受这些酶调控的同时，也与乙酰辅酶A以一种非酶依赖的方式相互作用，尤其在pH高的情况下。

研究表明线粒体蛋白乙酰化修饰主要是以非酶依赖的过程为主。这些证据包括，超大数量的乙酰化位点，大部分位点化学计量极低，线粒体基质中pH增加，线粒体基质中各种乙酰辅酶A的局部浓度增加。Wagner和Payne通过体外控制这些变量阐明了线粒体蛋白的非酶依赖的乙酰化修饰。他们指出基础pH和乙酰辅酶A水平的重要性，并发现在一段时间内变性线粒体蛋白呈现较高的乙酰化水平。

线粒体蛋白酰基化修饰的调控

尽管线粒体酰基化修饰的具体机制仍需进一步的研究，现在已发现多种干预因素可影响这种修饰行为，这也为拟通过酰基化修饰及去酰基化修饰的治疗提供了新的机遇。饮食摄入及各种组织自身的代谢需求产生乙酰辅酶A，与线粒体中的分子相互作用使靶蛋白发生乙酰化，而sirtuins通过NAD+使之朝相反的方向发展。

营养过剩与营养不良均产生异常的代谢状态，使乙酰辅酶A水平增加。禁食状态下，乙酰辅酶A用于产生能量，肝脏大量合成糖原及酮体。研究发现SIRT3缺失抑制了脂肪酸氧化；同时发现冷刺激使糖异生降低，禁食状态下β-羟丁酸产生减少。线粒体蛋白的高度乙酰化降低了机体对禁食的适应性，而禁食状态下SIRT3表达增加则拮抗了这一效应。相较于禁食而言，能量限制时肝脏及肾脏线粒体乙酰化增加，但脑内乙酰化水平没有变化，骨骼肌乙酰化却降低。另一方面，营养过剩则使肝脏中线粒体乙酰化水平减低。

大部分线粒体代谢通路产生高能量的辅酶A硫脂作为关键的中间产物。（图2）丙酮酸来源的乙酰辅酶A是TCA循环的主要来源，琥珀酰辅酶A是此循环中另一个重要的中间产物。此外，各种辅酶A中间产物进入氨基酸及脂肪代谢途径，如果没有线粒体非酶依赖的赖氨酸乙酰化，那么TCA循环中各种酰基辅酶A则是组织中乙酰化修饰的主要来源。

图2. 线粒体代谢的中间产物，辅酶A

在应激条件下，线粒体sirtuins表达增加，控制着线粒体蛋白的乙酰化水平。禁食及PGC-1α使SIRT3上调，使之更好的控制脂肪酸氧化及酮体代谢产生的高度乙酰化水平。同样地，DNA损伤时SIRT4表达增加，来调控损伤应激反应。作为线粒体内仅已知的去乙酰化酶，sirtuins需要NAD+的辅助来发挥作用。NAD+在线粒体代谢中主要作为电子传递体，是目前老龄化领域研究的一个热点。

线粒体酰基化——生物学效应

线粒体酰基化常常起到抑制性作用，而在其他细胞成分中，蛋白酰基化则具有抑制或者激活双重作用。丙酮酸代谢是线粒体氧化代谢的关键起始点，丙酮酸脱氢酶复合体（PDC）控制着TCA循环的活性，产物乙酰辅酶A推动TCA循环的进程。PDC受到各种酶的竞争性调控，如丙酮酸脱氢酶激酶（PDKs），通过磷酸化作用使PDC失活，而丙酮酸脱氢酶磷酸酶（PDP）则逆转了PDKs的抑制作用。乙酰化的PDHA1招募PDK，使PDC发生磷酸化进而失去活性。相反，SIRT3起激活PDC的作用。

禁食时，SIRT3激活长链乙酰辅酶A脱氢酶，利用脂质产生乙酰辅酶A。SIRT3缺失小鼠发生β-氧化前体物质和中间产物的堆积，并且产生类似人类脂肪酸氧化失调的症状，如寒冷耐受能力及基础代谢降低。越来越多的证据表明赖氨酸乙酰化和sirtuins在酮体合成代谢中起重要调控作用。研究发现禁食时，SIRT3或SIRT5缺失小鼠酮体生成减少。HMG-CoA合成酶异构体2（HMGCS2）是酮体生成中的限速酶，使乙酰辅酶A合成HMG-CoA，SIRT3和SIRT5通过去乙酰化和去琥珀酰化作用调控HMGCS2的活性。ROS是线粒体代谢的产物，同时也引起氧化应激反应。SIRT3使抗氧化应激的两种酶MnSOD和IDH2乙酰化，对抗氧化应激反应。

线粒体酰基化——疾病或者健康

肿瘤发生的机制研究甚广，SIRT3在不同的肿瘤环境中对肿瘤的发生、生长、转移引起的效应不同。在Warburg效应中，SIRT3使ROS产生减少，在一定程度上抑制了糖酵解过程。SIRT4通过抑制脂肪酸氧化及谷氨酰胺代谢，间接使代谢呈糖依赖性，但SIRT4使代谢减慢，并对糖抑制更加敏感，最终抑制肿瘤生长。研究发现SRIT3有抗凋亡作用，SIRT3的缺失使肿瘤微环境有利于肿瘤的生长。

鉴于线粒体乙酰化在肿瘤发生及ROS产生中的重要作用，那么线粒体乙酰化同时调控神经功能便不足为奇，研究发现sirtuins的去乙酰化作用能够改善神经功能。最近有研究发现SIRT3可以抵抗氧化应激对觉醒驱动的伏隔核区的损伤，同时也可减少兴奋毒性应激导致的细胞死亡。热量限制延长了寿命并减缓老龄化进程，而SIRT3在CR对抗老龄化的保护作用中发挥重要作用。营养过剩及其所带来的肥胖、糖尿病等，主要归因于乙酰辅酶A前体的过度利用，这一过程驱动线粒体乙酰化发生。目前的研究发现线粒体乙酰化在代谢性疾病中有双重作用，SIRT3缺失小鼠表型与人类相似，人SIRT3多态性引起的去乙酰化活性降低增加了代谢性疾病发生的风险。

年龄是多种疾病发生的关键因素之一，sirtuins对抗老龄化的机体保护作用使其获得了“抗衰老”蛋白的美誉，尽管sirtuins不能改变所有有机体老龄化的速率，但sirtuins抑制疾病进展并延长了寿命。SIRT3一方面减弱了应激的不利影响，另一方面增强了机体在应激状态中的生存能力，从而保护机体抵抗氧化应激。而老龄化对sirtuins的功能也产生一定的影响。NDA+呈现年龄依赖性减少，限制了sirtuins的作用；在老龄化中，破坏NAD的酶CD38抑制SIRT3对线粒体高度乙酰化的控制从而导致线粒体功能失调。

论肿道麻的点评：乙酰化将何去何从？

目前的研究为我们提供了一个大规模又复杂的数据库，涉及大量蛋白的乙酰化修饰。与此同时，日益增多的线粒体蛋白的乙酰化作用影响了各种酶的功能，而我们对乙酰化机制及调控的研究也逐渐加深。目前悬而未决的关键问题是多数乙酰化的化学计量问题。除了基于SILAC的化学计量方法，所有的化学计量方法发现所有线粒体蛋白乙酰化位点平均不足1%。这引起了乙酰化作用在生物学领域的激烈争议。除非乙酰化修饰产生新的作用或者激活新的酶，否则1%的乙酰化水平不足以在体内发挥抑制作用。另一方面，SIRT3、SIRT4、或SIRT5缺失小鼠的代谢表型通路呈现出高度乙酰化水平。未来需要更多的研究来探讨并阐释这一问题。而且，乙酰化修饰范围的增加进一步扩展了现阶段对亲核反应如脂肪酸和氨基酸代谢中间产物的认识。这不禁让我们产生疑问，是否还存在其他目的蛋白也同时发生乙酰化。

综上所述，赖氨酸残基的翻译后修饰-乙酰化，存在于各种通路、功能及机体相关的蛋白中。SIRT3、SIRT4及SIRT5，三个定位于线粒体的去乙酰化酶，以NDA+依赖的方式对其靶蛋白进行去乙酰化修饰。线粒体蛋白乙酰化修饰的蛋白组学研究也发现了SRT3、SIRT5调控的蛋白乙酰化、琥珀酰化、戊二酰化及丙二酰化等其他酰基化修饰作用。线粒体乙酰化修饰受到饮食、乙酰辅酶A的浓度及环境、sirtuins、NAD+等多种因素的调节。酰基化修饰不仅参与了线粒体氧化应激、酮体生成、脂肪酸代谢、糖代谢中各种酶的表达，并且参与了肿瘤、神经系统疾病、代谢综合征、肥胖、糖尿病等多种疾病的发生发展过程。未来线粒体酰基体及sirtuins仍需更广泛更深入的研究，来阐释其在代谢及疾病发生发展的作用，为治愈疾病提供新的思路和策略。

（编译陈祥元；审校缪长虹）

参考文献：