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Biacore经典文章赏析 | DNA与蛋白相互作用

GE生命科学 2019-06-27 04:47:02


中科院微生物所与中科院生物物理所合作,研究了泉古菌中核染色质蛋白Cren7与DNA的相互作用结构基础。Biacore实验由中科院生物物理所高级工程师陈媛媛老师完成。


Cren7是一个新发现的核染色质蛋白,在泉古菌中高度保守。Cren7蛋白对双链DNA的亲和力高于单链DNA,在体外约束DNA负超螺旋,在体内与基因组DNA关联。作者解析了Cren7蛋白与DNA的复合体晶体结构,通过突变加SPR相互作用分析,检验了Cren7蛋白上与DNA互作相关的氨基酸残基。


SPR实验使用Biacore 3000仪器在25摄氏度完成。Running buffer为50mM Tris-Cl, pH 7.6, 100mM NaCl, 0.005% (v/v) Tween 20。在SA传感芯片上稳定捕获生物素标记的互补寡核苷酸链91-97RU。一个空白通道用作参比,来效正仪器误差和容积效应的影响。野生型和突变型Cren7蛋白根据不同蛋白-DNA结合强度调整浓度梯度范围进行进样,流速30 μL/min,同时流经空白通道和DNA通道,进样2分钟。解离2-4分钟后,使用0.01% SDS进样30秒,洗去蛋白做芯片再生,进样buffer 60秒使基线稳定。每个浓度都做了一次重复实验。平衡和动力学常数使用1:1 Langmuir结合模型(BIA evaluation 4.1 software)Global fits计算得出。


图一


最终使用SPR测定了Cren7的10个单点突变(替换为丙氨酸)突变体与30bp 双链DNA片断的结合。所有的突变体对于DNA的结合亲和力都有所降低。28位亮氨酸突变为丙氨酸后,导致了最大程度(54倍)的亲和力降低,对于结构分析中此残基的重要性提供了有力的证据。Trp26,Arg51和Lys53对于DNA结合也同样重要,突变后亲和力分别降低了30,23,24倍。根据蛋白-DNA复合物的结合和解离速率,这些突变体可以分为三类。K24A和R33A属于第一类,结合和解离速率均有所提高,亲和力稍稍降低。可能由于互作表面的电势变化促进了DNA结合但使蛋白-DNA复合体稳定性下降。第二类包括P30A,K31A,V36A和Y49A,解离速率显著提高,结合速率稍稍提高。第三类包括W26A,L28A,R51A和K53A,与DNA的亲和力最低,由于解离速率的显著提高而导致。这4个残基对于稳定蛋白-DNA复合物起了最大的作用。


图二


图三



参考文献

Zhang,Z.F., Li,Y.G., Jiang,G.T.,and Li,H. (2010) Structural insights into the interaction of the crenarchaeal chromatin protein Cren7 with DNA. Molecular Microbiology 76(3), 749–759




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